Tinción de Gram

TINCIÓN DE GRAM:

Grupo 3. Laboratorio Clínico y Biomédico

Créditos: Azahara Gómez Romero, Carmen Jaime Muesa, María Luna Da Cruz, Andrea Muñíz Nieto, Claudia Sánchez Pato y Mariana Silva García.

Docente: Cristina Pulido

1. Introducción.

Los protocolos y algoritmos de identificación bacteriana suelen comenzar con la observación y descripción de las características morfológicas microscópicas de la bacteria problema. Para ello es necesario la elaboración de un frotis bacteriológico, su tinción diferencial y posterior observación microscópica. La tinción de Gram es la más empleada en bacteriología y permite, además la observación bacteriana.

La tinción de Gram divide a las bacterias en dos grandes grupos: Gram+ y Gram-. Esta división, que se manifiesta en la observación microscópica al aparecer las bacterias teñidas de azul/violeta o rojo/rosa, es consecuencia de la diferente composición de la pared celular de unas y otras bacterias.

2. Objetivos.

1. Aprender la técnica de la tinción de Gram.

2. Identificar bacterias grampositivas y gramnegativas vistas en el microscopio.

Otros objetivos secundarios son:

1. Practicar la correcta observación al microscopio.

2. La utilización del  mechero de alcohol.

3. La realización de una extensión en un portaobjetos, con la muestra anteriormente sembrada.

3. Materiales.

1. Papel de filtro.

2. Pipetas Pasteur.

3. Cristalizador.

4. Puente de tinción.

5. Pinzas de madera.

6. Portaobjetos.

7. Frasco lavador con agua destilada

8. Mechero de alcohol.

9. Asa de siembra.

10. Microscopio óptico.

11. Colorantes para la tinción (Cristal violeta o violeta de genciana, lugol, decolorante de Gram y Safranina)

4. Modus operandi.

1. El modus operandi de esta práctica comienza con la recolección del material necesario para la realización de la práctica. Necesitaremos: cristalizador, pipetas Pasteur, puente de tinción, pinzas, portaobjetos, agua destilada, mechero de alcohol, asa de siembra y los colorantes propios de la tinción de Gram. 

2. Encendemos el mechero de alcohol con un mechero común. Una vez encendido procedemos a hacer el frotis de la muestra sobre el portaobjetos, para ello colocamos una gota de agua en el portaobjetos y tomamos el inóculo de la placa correspondiente. Extendemos el inóculo por el portaobjetos y esterilizamos el asa de siembra con el mechero de alcohol.

3. Una vez extendida la muestra sobre el portaobjetos procederemos a fijar las bacterias mediante una fuente de calor, el mechero de alcohol. Para ello sostendremos el portaobjetos con unas pinzas y lo pasaremos con cuidado por encima de la llama del mechero hasta que el agua se haya evaporado por completo y se observe la muestra de un color blanquecino.

4. A la hora de utilizar el mechero hay que tener cuidado con que la temperatura del portaobjetos no sea demasiado alta. Para evitarlo comprobaremos constantemente con nuestra mano si el portaobjetos se mantiene a una temperatura caliente pero no que queme.

5. Posteriormente pasaremos a la tinción en sí de la muestra, pero no sin antes apagar el mechero para evitar accidentes de trabajo. Para teñir las bacterias utilizaremos Cristal violeta o violeta de genciana, lugol, colorante de Gram (alcohol) y safranina. 

6. Colocaremos el portaobjetos sobre el puente de tinción en el cristalizador con un poco de agua en el fondo de éste último. El primer paso para la tinción es cubrir el portaobjetos por completo con cristal violeta durante 1 minuto.

7. Una vez pasado el minuto, retiraremos el colorante y quitaremos el exceso con agua destilada. A continuación, añadiremos Lugol sobre la muestra que actuará como mordiente fijando el colorante primario y lo dejaremos actuar durante 1 minuto.

8. Retiramos el exceso de lugol con agua destilada de nuevo y a continuación decoloramos la muestra añadiendo alcohol o alcohol-acetona al 30% (decolorante de Gram). Añadir el decolorante durante 30 segundos.

9. Retiramos el exceso de nuevo con abundante agua destilada y pasamos a cubrir el portaobjetos añadiendo el colorante de contraste safranina y dejar actuar durante 1 minuto.

10. Una vez pasado el minuto, retiramos el exceso con agua destilada y dejamos secar. Cuando veamos que la muestra está completamente seca la observamos al microscopio con el objetivo de 40x y con el de 100x, en el cual añadiremos aceite de inmersión para lograr mejor visualización.

                                                           40x                                                                                                                                                 100x

6. Conclusiones.

En primer lugar, a la hora de echar la gota en el portaobjetos, debe contener poca cantidad

de agua para que así sea más fácil de secar. Es importante también evitar la salida de humo tras el contacto del portaobjetos, que contiene la muestra bacteriana inmersa en una gota de agua, con la llamarada de fuego procedente del mechero de alcohol debido a que sino la muestra se quemaría. Así como, cada cierto tiempo, darnos cuenta de la temperatura que coge el portaobjetos y esto se hace depositándolo sobre la mano.

Además, hay que tener en cuenta los tiempos de tinción, en especial los 30 segundos con alcohol-acetona y a la hora de lavar utilizando el frasco lavador, no depositar el agua destilada directamente sobre la muestra sino, dejarla caer desde un extremo y que se vaya cayendo la tinción al cristalizador relleno de agua para que no se queden marcas de tinción en él. Una vez terminada la tinción, debemos dejar secar el portaobjetos lo suficiente antes de visualizar la muestra por el microscopio. 

Tras la realización de la práctica, hemos podido aprender a visualizar bacterias en el microscopio a partir de un medio de cultivo, utilizando por primera vez el mechero de alcohol. Para llevar a cabo la práctica hemos utilizado la Tinción de Gram, la cual es de color púrpura. Cuando la tinción se combina con la bacteria en una muestra, las bacterias pueden visualizarse bien del mismo color que la tinción o bien rosas, rojas. Esta diferencia tintorial entre un grupo de bacterias y otro que nos permite diferenciarlas, es debido a la composición de sus paredes celulares. Tras la cual se pueden diferenciar bacterias grampositivas y gramnegativas debido a sus diferentes propiedades tintoriales que son producidas por la composición de sus paredes celulares.