INMUNOELECTROFORESIS

INMUNOELECTROFORESIS 

Grupo 4 

Marina Gonzalez Picarzo, Andrea Lozano, Irene Macías, Lara Merino, Marta Pintado, Lucia Sánchez

Docente: José Luis Rozas

INTRODUCCIÓN 

La inmunoelectroforesis se utiliza en laboratorios clínicos y de investigación para separar e identificar proteínas en base a su comportamiento electroforético y a sus

propiedades inmunológicas. Proteínas, tales como proteínas de suero de conejo, que son antígenos, cuando se inyectan en otro animal, como una cabra (el huésped), provocan la producción de anticuerpos en el huésped. La interacción entre el antígeno y su anticuerpo, que es también una proteína, es a la vez fuerte y altamente específica. Si se mezclan soluciones de antígeno y anticuerpo en diferentes proporciones, se encuentra que a una razón específica, conocida como punto de equivalencia, se maximiza la unión y se forma un precipitado de complejo antígeno-anticuerpo.

En el laboratorio clínico, la inmunoelectroforesis se utiliza diagnósticamente. Se utiliza en el examen de ciertas anomalías del suero, especialmente aquellas que implican inmunoglobulinas, proteína de orina, líquido cefalorraquídeo, fluidos pleurales y otros fluidos corporales. En la investigación, este procedimiento puede usarse para monitorizar purificaciones de antígenos y/o anticuerpos, detectar impurezas, analizar antígenos solubles de tejidos vegetales y animales y extractos microbianos. La electroforesis en gel es un método analítico ampliamente utilizado que separa las moléculas basadas en la carga, el tamaño y la forma. Es particularmente útil para determinar el tamaño de las biomoléculas. Las muestras de proteínas se cargan en pocillos hechos en el gel al solidificarse. El gel, que consta de poros microscópicos que actúan como un tamiz molecular, se coloca en una cámara que contiene una solución tampón y electrodos. La corriente se aplica desde una fuente de alimentación de corriente continua (DC). Dado que las biomoléculas se cargan, migrarán a través del gel.

En la inmunoelectroforesis, las proteínas se separan por primera vez mediante electroforesis en gel de agarosa horizontal sobre la base de sus diferentes relaciones de carga a masa. El gel con las proteínas separadas (antígenos) se retira entonces del campo eléctrico y los anticuerpos para las proteínas se introducen en canales estrechos paralelos a los antígenos separados. Se produce la difusión de ambos anticuerpos antigénicos y, en un locus particular, se alcanza el punto de equivalencia que da como resultado la precipitación. El propósito de este experimento es demostrar el uso de inmunoelectroforesis para separar y caracterizar una mezcla de proteínas de suero, así como para examinar la especificidad de la interacción antígeno-anticuerpo.

OBJETIVOS 

• Introducirnos en el uso de la inmunoelectroforesis para separar y caracterizar una mezcla de proteínas.  

• Examinar la especificidad de la interacción antígeno-anticuerpo. 

MATERIALES

• Aparato de electroforesis horizontal

• Fuente de alimentación

• Micropipetas automáticas y puntas (5-50 μl)

• Baño de agua

• Portaobjetos para microscopio (1" x3")

• Agua destilada

• Vaso de precipitación de 400 a 600 ml

• Probeta graduado de 1000 ml

• Microondas

• Contenedor con tapa 

• Papel de filtro

• Envoltura o lámina de plástico (film transparente)

• Estufa de Incubación (37ºC)

PROCEDIMIENTO 

1. Mezclar 1,0 g de polvo de agarosa con 100 ml de tampón de electroforesis diluido en un matraz. Para ello, se disuelve el polvo de agarosa hirviendo la solución con el microondas durante unos segundos hasta que la agarosa se disuelva por completo (solución transparente como el agua).

2. La solución de agarosa enfriada se coloca en la bandeja de gelificación.  Es importante poner el formador de canales en el centro de la bandeja para formar simultáneamente los dos canales antes de que la agarosa se solidifique. 

3. El gel se endurecerá y se volverá menos transparente a medida que se solidifique. En ese momento, se quitan cuidadosamente las tapas de los extremos y el formador de canales. 

5. Cortar y retirar los pozos A, B y C, usando un cortador de pozos dejando una distancia de 0,5 cm  entre los canales y el borde de cada pocillo 

5. Se transfiere el gel (todavía en la bandeja) a la cámara de electroforesis. Y se vierte el tampón de electroforesis diluido en los pocillos laterales del aparato sin sumergir el gel.

6. Se coloca suavemente las mechas de papel de filtro sobre los extremos del gel presionando ligeramente para asegurar un buen contacto entre el gel y el tampón de electroforesis. 

7. PRESIONAR ligeramente sobre las mechas para asegurar un buen contacto entre el gel y el tampón de electroforesis. Las mechas deben estar sumergidas en el tampón. Si es necesario, agregar más tampón, pero NO cubrir el gel con tampón.

8. PIPETEAR 20 uL de las muestras A, B y C en los pocillos como se indica en la Tabla. 

• Muestra A: IgG

• Muestra B: Muestra Problema

• Muestra C:  Albúmina

9. Cambiar las puntas de pipeta entre muestras. 

10. COLOCAR la cubierta de seguridad en la unidad.

11. CONECTAR los cables a la fuente de alimentación con el cable negro en la entrada negra (negativa) y el cable rojo en la entrada roja (positiva). ENCENDER y configurar la fuente de alimentación. Consultar la Tabla B para conocer el voltaje recomendado.

12. Cuando la corriente fluye correctamente, se deben formar burbujas en los electrodos.

13. EJECUTAR la electroforesis hasta que el tinte azul haya migrado a los extremos de los canales. El tiempo exacto requerido depende del voltaje. 

• 150 voltios: mínimo 15 min/ máximo 30 min

• 125 voltios: mínimo 30 min/ máximo 45 min

• 75 voltios: mínimo 35 min/ máximo 70 min. 

14. Después de completar la electroforesis, APAGAR la alimentación, desconectar la fuente de alimentación, DESCONECTAR los cables y retirar la cubierta.

15. DESECHAR las mechas de papel de filtro y RETIRAR la bandeja de gel del aparato.

16. COLOCAR la bandeja en una superficie nivelada.

17. PIPETEAR 50 µL de cada anticuerpo en el canal apropiado. Utilizar la punta de la pipeta para DISTRIBUIR con cuidado la solución de anticuerpos a lo largo de toda la cubeta. 

18. CAMBIAR las puntas de pipeta entre muestras.

19. COLOCAR la bandeja en una cámara de humidificación cerrada que contenga papel de filtro humedecido.

20.DEJAR que la difusión se lleve a cabo durante un período de 24 a 48 horas, o hasta que se formen precipitados visibles en el gel. La cámara se puede colocar en una incubadora a 37 °C o permanecer a temperatura ambiente.

CONCLUSIÓN 

Esta práctica se realizó correctamente ya que en la imagen, podemos observar perfectamente la formación de las bandas en el gel. Esto indica la interacción antígeno-anticuerpo, aunque era de esperar varios arcos de migración ya que el anticuerpo dispensado entre el pocillo B y C son anticuerpos policlonales.

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