Antibiograma
Antibiograma disco-placa
Grupo 1 LCB 2
Créditos: Ana Isabel Arroyo, Belén Shi Asensio, Lucía Campos, Juana Galán, Laura Jiménez y Concepción Moreno
Docente: Cristina Pulido
1.- Introducción
El crecimiento bacteriano puede ser inhibido por algunas sustancias entre las que se encuentran los antibióticos. La inhibición que producen depende de la sensibilidad de cada cepa bacteriana a un antibiótico concreto.
El antibiograma disco-placa según la técnica de Kirby-Bauer es uno de los métodos autorizados por el National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) para la realización de pruebas de sensibilidad a antimicrobianos.
La técnica se realiza colocando unos discos de papel secante impregnados con antibiótico sobre la superficie del agar previamente inoculado con la bacteria. El disco comienza a absorber agua y el antibiótico difunde hacia el medio de forma radial. Esto crea un gradiente de concentración de antibiótico alrededor del disco de forma que, el crecimiento bacteriano será inhibido allí donde la concentración del antibiótico sea igual o mayor al CMI.
Teniendo en cuenta esto, se determina que una bacteria será más sensible a un antibiótico cuanto mayor sea el halo de inhibición que se genera en torno al disco impregnado con ese antibiótico.
2.- Objetivos
Usar la escala McFarland 0.5 para ajustar la turbidez de la suspensión bacteriana.
Sembrar por extensión en placa de varios microorganismos con hisopo.
Realizar un antibiograma en agar Mueller-Hinton para cada microorganismo sembrado.
Usar varios antibióticos para ver la sensibilidad o resistencia de cada microorganismo a cada uno de ellos.
Usar un mechero Bunsen para la esterilización del material por calor
Colocar discos de antibióticos en placa con pinza estéril.
Incubar las placas durante 24 h en aerobiosis.
Realizar la lectura de los antibiogramas.
3.- Materiales
Mechero Bunsen
Vórtex
Portaobjetos
Hisopos de algodón estériles
Asa de Digralsky
Discos de susceptibilidad: fosfomicina, penicilina G, ampicilina, gentamicina, amoxicilina y amoxicilina-clavulánico
Patrón 0,5 de McFarland
Agua estéril
4.- Modus operandi
El primer paso, como en todas las prácticas, sería reunir los materiales necesarios: microorganismos en medio líquido, hisopos, mechero Bunsen, discos de diferentes antibióticos, placas de Petri con medio de cultivo Müeller-Hinton, agua estéril, pinzas y tubo 0.5 de turbidez en la escala McFarland.
El siguiente paso sería ajustar la turbidez del medio de cultivo líquido con el microorganismo para que tenga una turbidez del 0,5 en la escala McFarland, para ello, lo comparamos visualmente con el tubo que ya tenemos preparado de la práctica anterior, previamente homogeneizado con ayuda del vórtex. En el caso de que la turbidez sea mayor necesitaríamos diluir la muestra con agua estéril hasta conseguir una turbidez parecida visualmente.
Una vez tiene ya la turbidez adecuada, podemos proceder a sembrar. Nos colocamos cerca del mechero, dentro de la zona estéril. Los pasos serían los siguientes:
Quitamos el tapón con ayuda del dedo meñique de la mano derecha, con la mano izquierda sujetamos el tubo
Pasamos la boca del tubo ligeramente sobre la llama para esterilizar
Cogemos el hisopo y lo introducimos en el tubo con el microorganismo, realizamos unos movimientos en círculo
Antes de sacarlo lo presionamos ligeramente contra la pared del tubo para eliminar el exceso de líquido
Volvemos a pasar la boca del tubo por la llama del mechero para volver a esterilizar y lo cerramos.
Sembramos toda la superficie de la placa con movimientos de zigzag, con ayuda del hisopo y lo desechamos. Cerramos la placa.
Lo siguiente sería colocar los discos de antibiótico para realizar el antibiograma, en este caso hemos utilizado cinco antibióticos distintos: penicilina-G (PG), gentamicina (G), ampicilina (A), fosfomicina (F) y amoxicilina con clavulánico (AC).
Antes de poner los discos es necesario rotular la placa, hacer 5 puntos para saber donde colocaremos los antibióticos, cuatro haciendo un cuadrado lo más alejado posible uno de otro pero no demasiado cerca del borde de la placa y uno en el centro, y qué antibiótico vamos a colocar en cada uno, para que, a la hora de la lectura, no haya confusiones y el resultado sea el correcto. Además también sería conveniente poner el microorganismo que se ha sembrado.
Para colocar los discos primero esterilizamos las pinzas con ayuda del mechero Bunsen y dejamos enfriar.
Con cuidado sacamos un disco de antibiótico del envase (1) y lo colocamos con cuidado de no tocar el agar con la pinza en su sitio correspondiente (2), apretamos ligeramente el disco con la pinza (3) y cerramos, volvemos a esterilizar la pinza y realizamos la misma operación con el resto de discos: esterilizamos la pinza, dejamos enfriar, cogemos el disco, lo colocamos, lo presionamos ligeramente y cerramos la placa (4).
Una vez colocados los cinco discos lo último sería incubar durante mínimo 24h y observar si ha habido inhibición en el crecimiento o no, y en el caso de que haya habido, medir el diámetro del círculo de inhibición.
Sembramos tres placas distintas con un microorganismos cada una. Los microorganismos sembrados fueron: Klebsiella, Staphylococcus epidermidis y Escherichia coli.
5.- Resultados
Transcurrido el tiempo de incubación tras la colocación de los discos de antibióticos los resultados obtenidos en cada placa fueron los siguientes:
El microorganismo sembrado en esta placa es Klebsiella y su respuesta a los antibióticos fue:
-Amoxicilina: no creó un halo de inhibición por lo que es resistente al antibiótico.
-Amoxicilina /clavulánico: podemos apreciar un pequeño halo de 15 mm que nos indica sensibilidad al antibiótico.
-Fosfomicina: formó un halo de 22 mm, presentando una gran sensibilidad.
-Gentamicina:se aprecia un halo de 23 mm que nos indica que la bacteria es sensible al antibiótico.
-Penicilina G: no formó halo a su alrededor por lo que nos indica que es resistente al mismo.
El microorganismo sembrado en placa es Staphylococcus epidermidis y los resultados de su antibiograma son:
-Amoxicilina: presenta un halo de 1 mm por lo que presenta resistencia al antibiótico debido a su escaso tamaño.
-Amoxicilina/clavulánico: se aprecia un halo mayor, exactamente 11 mm pero no es lo suficiente amplio para indicar que es sensible al antibiótico.
-Fosfomicina: se observa un gran halo de inhibición de 65 mm que nos indica que es muy sensible a éste antibiótico.
-Gentamicina: presenta un halo de 32 mm así que es sensible al antibiótico.
-Penicilina G: no se observa halo a su alrededor indicando una resistencia a él.
El microorganismo sembrado en la placa es Escherichia coli y los resultados del antibiograma son:
-Amoxicilina: no ha formado halo de inhibición por lo que es resistente.
-Amoxicilina/clavulánico: es una bacteria resistente ya que no existe halo de inhibición alrededor del disco.
-Fosfomicina: presenta un halo de inhibición de 29 mm por lo que es sensible aunque dentro del halo podemos apreciar pequeñas colonias que nos indican que hay cepas resistentes al antibiótico dentro de la misma especie.
-Gentamicina: podemos observar un pequeño halo de 18 mm que nos indica que es sensible a este tratamiento.
-Penicilina G: la bacteria es resistente a la penicilina debido a que no se ha producido un halo alrededor del disco.
6.- Conclusiones
Tras realizar la incubación de la placa, una vez obtenido el antibiograma pudimos confirmar que la colocación de los discos fue correcta, manteniendo la distancia entre ellos y con el borde de la placa.
Algunos antibióticos han creado un halo de inhibición con un diámetro amplio lo que ha provocado que se solapen unos con otros y hayan dificultado su medición.
Uno de los inconvenientes encontrados ha sido la turbidez de la suspensión bacteriana porque al tener un color amarillento nos dificulta la comparación con la escala 0.5 de McFarland, en nuestro caso no ha sido necesario ajustar la turbidez en ninguno de los tres microorganismos.
Para medir la turbidez hemos usado la escala McFarland de otros compañeros, ya que la nuestra presentaba mayor turbidez que las del resto y hemos decidido no utilizarla.
También con algunos antibióticos hemos tenido que utilizar dos discos porque al retirarlos del recipiente la pinza estaba demasiado caliente debido a la esterilización y los ha quemado.