Microbiota orofaríngea

Grupo 2

Ana Isabel Arroyo Gil, Álvaro Crespo Cardoso, Javier Fernández Delgado, Raúl Gragera Traver, Luis Miguel Lavado Gómez


Docente: Cristina Pulido 

En esta práctica vamos a tratar de identificar los microorganismos más representativos de la región orofaríngea. Para el cultivo de los mismos se va a hacer uso de un medio suplementado con sangre, en nuestro caso agar sangre, ya que proporciona un alto número de factores de crecimiento y facilita a aquellos microorganismos que tienen mayores requerimientos nutricionales a crecer. Además, el medio de cultivo nos proporciona información sobre la patogenicidad del microbio en base a la hemólisis producida en el mismo.


La zona orofaríngea es colonizada a las pocas horas del nacimiento y a partir de ese momento se va conformando lo que será la microbiota de la boca, orofaringe y nasofaringe que nos caracterizará a cada uno de nosotros. Esto es debido a que, al igual que la microbiota intestinal, ésta también depende de la situación ambiental de cada individuo y no existen dos personas con el mismo conjunto de microorganismos en la microbiota.

Además, esta microbiota es relativamente estable a lo largo del tiempo, aunque puede variar dependiendo del estado de la misma. Si hay enfermedades como gingivitis, periodontitis, alveolitis o la pérdida o extracción de piezas dentales se puede alterar la composición de la misma. También puede alterarla los alimentos ingeridos, los tóxicos inhalados (como el tabaco) o la deficiente higiene bucal.


Los principales microorganismos que podemos encontrar en la orofaringe son los siguientes:


Además, al tomar las muestras de lo que se presupone un individuo sano, no se espera obtener ninguna colonia bacteriana con beta-hemólisis, por lo que se tomará una muestra adicional cutánea de la mano para intentar observar algún microorganismo beta-hemolítico.


Por último, haremos una tinción de Gram para poder observar de forma más clara y poder discernir más fácilmente entre los tipos de bacterias que pueden crecer.

2. Objetivos

3. Materiales

4. Modus operandi 

4.1 Preparación de los materiales

Esta práctica está preparada para realizarse en dos días distintos, por lo que vamos a tener varias estaciones de trabajo en diferentes lugares y preparadas en distintos momentos.


En nuestro caso, tendremos:

Figura 1. Estación de trabajo para toma de muestra y siembra

Figura 2. Estación de trabajo para elección y extensión de colonias

Figura 3. Estación de trabajo para la tinción de las muestras

Figura 4. Estación de trabajo para la observación al microscopio

Como podemos observar en las figuras 1 y 3, ya se tienen ciertos reactivos en botes o tubos con la cantidad necesaria. Esto lo realizamos de esta manera para facilitarnos el trabajo posteriormente.

4.2 Preparación de los materiales

Antes de proceder con la toma de la muestra, deberemos preparar un tubo Falcon con 3 mL de agua destilada estéril. Para ello, tomaremos agua destilada estéril del bote de vidrio de agua destilada estéril (previamente esterilizado en el autoclave) y lo dispensamos en la zona estéril del mechero Bunsen (15 cm alrededor del mismo).

A continuación, pasaremos a rotular las tres placas de agar sangre con el identificador del grupo (G2) y el tipo de muestra  que es. En nuestro caso:

4.3 Preparación de los materiales

Figura 5. Ubicación del paladar blando

Seguidamente, el compañero que va a realizar la toma de la muestra se pondrá la mascarilla quirúrgica y realizará la toma de muestra con un hisopo estéril de otro compañero (que se encuentre bien de salud) de la zona del paladar blando sin tocar ni lengua ni dientes, ya que esto contaminaría la muestra.

Por último se pasará a realizar la siembra del hisopo sobre el medio de cultivo de agar sangre también en la zona estéril proporcionada por el mechero Bunsen. Tras sembrar la muestra, tapamos la placa y la invertimos.

Con esto, ya tendríamos la primera muestra lista. Ahora tomamos una segunda muestra también del paladar blando del mismo compañero de nuevo con un hisopo estéril pero en este caso deberemos realizar un paso previo a la siembra.

En este caso, al tomar la muestra, se sumergirá el hisopo en los 3 mL de agua destilada esteril rotando el mismo sobre las paredes del tubo Falcon y removiendo. Después lo dejaremos 30 segundos dentro del tubo antes de retirarlo y depositarlo en el contenedor apropiado.

La siembra también se ve modificada, ya que en este caso la muestra de la que disponemos ahora está en un medio líquido. Por esta razón tendremos que hacer uso de la micropipeta para dispensar un volumen de 100 μL sobre la placa de agar sangre. Para extenderla por toda la placa, deberemos hacer uso del asa de Drigalsky hasta que el inóculo quede repartido por toda la superficie de la placa y se haya absorbido por completo. Para concluir, cerramos la placa con la tapa e invertimos la placa apilándola sobre la anterior.

Para la toma de la última muestra deberemos quitar el guante de alguno de nuestros compañeros y tomar el inóculo de la palma de la mano con un hisopo estéril frotando sobre la misma en varias direcciones.

A la hora de realizar la siembra, hay que tener en cuenta que el hisopo estará mayoritariamente seco, por lo que habrá que ser extremadamente cuidadoso, ya que puede atascarse en el recorrido y arrancar parte del medio.

Figura 6. Toma de la muestra de la orofaringe

Figura 7. Siembra de la muestra de la orofaringe

Figura 8. Cambiando la muestra a un medio líquido y mucho más diluida

Figura 9. Inoculación del medio con la muestra líquida

Figura 10. Inóculo líquido procedente de la muestra líquida

Figura 11. Siembra por extensión con asa de Drigalsky

Figura 12. Toma de la muestra cutánea directa

Figura 13. Siembra de la muestra cutánea directa

4.4 Incubación en la estufa

Una vez realizadas todas las siembras, pasaremos a la incubación de las placas en la estufa a 37 ºC durante unas 24 horas o hasta observar crecimiento en las placas.

Puede que tras la incubación observemos las placas más oscurecidas o incluso similares a las de agar chocolate, pero esto es debido a la alfa-hemólisis de las colonias bacterianas.

Figura 14. Incubación de las placas de agar sangre en la estufa

Figura 15. Resultado de la incubación de la placa de agar sangre del hisopo orofaríngeo diluido en agua

Figura 16. Resultado de la incubación de la placa de agar sangre del hisopo orofaríngeo directo

Figura 17. Resultado de la incubación de la placa de agar sangre del hisopo cutáneo directo

4.5 Selección y extensión de las colonias microbianas

Para la selección de las colonias deberemos tener en cuenta lo siguiente:

Para poder observarlas de forma clara, debemos hacerlo sobre una fuente de luz y ahí detectar o no la presencia de hemólisis en el medio.

Figura 18. Colonia γ-hemolítica seleccionada

Figura 19. Colonia β-hemolítica seleccionada

Figura 20. Colonias α-hemolíticas seleccionadas

En nuestro caso y pese a ser un cultivo mixto, como hemos observado en las figuras 15, 16 y 17, hemos sido capaces de extraer de forma casi totalmente aisladas colonias para su posterior observación.

Una vez seleccionadas las colonias, encendemos el mechero de alcohol y procedemos a realizar la extensión en portaobjetos y su fijación por calor, para ello:

Figura 21. Toma de las colonias α-hemolíticas seleccionadas

Figura 22. Colonia β-hemolítica seleccionada

Ahora solo quedaría fijar las bacterias de la colonia al portaobjetos por calor, para ello:

Figura 25. Colonia fijada al portaobjetos por calor

Figura 26. Comprobación de la correcta fijación de las colonias al portaobjetos (sobre un fondo oscuro)

Este proceso lo deberemos repetir para aquellas colonias microbianas que se quieran teñir para su posterior observación al microscopio.

4.6 Tinción de Gram

Para la realización de la tinción de Gram, serán necesarios cuatro reactivos, como se ha indicado anteriormente: cristal violeta, lugol, decolorante de Gram y safranina). Es muy importante la correcta medida de los tiempos, especialmente con el decolorante para su correcta observación. El procedimiento es el siguiente:

Con esto, solo quedaría dejar secar totalmente la muestra para su posterior observación al microscopio.

Figura 27. Muestras siendo cubiertas con el colorante primario

Figura 28. Lavado del colorante primario con agua destilada

Figura 29. Muestras siendo cubiertas con el mordiente

Figura 30. Lavado del mordiente con agua destilada

Figura 31. Muestra siendo cubierta con el decolorante de Gram

Figura 32. Lavado del decolorante de Gram. Aquí se puede observar la hidrofobicidad de esta solución

Figura 33. Muestras siendo cubiertas por el colorante de contraste

Figura 34. Lavado del colorante de contraste con agua destilada

Es posible que al añadir los reactivos y los consecuentes lavados se borren el identificador si se ha escrito con un rotulador permanente o bolígrafo. Se recomienda hacer uso de un lápiz de grafito.

4.7 Observación al microscopio

Para la observación al microscopio se deberá realizar una calibración del mismo como se ha realizado con anterioridad y realizar una limpieza tanto de los oculares como de las lentes.

A continuación, se pondrá el portaobjetos sobre la platina y se enfocará con el macrométrico y posteriormente con el micrométrico hasta observar la muestra. Se continuará con los objetivos de 10X, 40X y para el de 100X se añadirá una gota de aceite de inmersión.

Figura 35. Enfoque y observación con el objetivo de 4X

Figura 36. Colocación de la gota de aceite de inmersión en el portaobjetos para la visualización de la muestra con el objetivo de 100X

5. Resultados

Hemos observado agrupaciones bacterianas y la interpretación que podemos hacer de la identificación es la siguiente:

Figura 37. Tinción de Gram para la extensión de la colonia β-hemolítica

Muestra cutánea (Figura 37):

Figura 38. Tinción de Gram para la extensión de la colonia γ-hemolítica

Muestra orofaríngea (Figura 38):

Figura 39. Tinción de Gram para la extensión de la colonia α-hemolítica

Muestra orofaríngea (Figura 39):

6. Conclusiones

Hemos podido realizar con facilidad los diferentes procedimientos llevados a cabo en la práctica. Además, hemos podido comprobar que: