Microbiota orofaríngea

En esta práctica vamos a tratar de identificar los microorganismos más representativos de la región orofaríngea. Para el cultivo de los mismos se va a hacer uso de un medio suplementado con sangre, en nuestro caso agar sangre, ya que proporciona un alto número de factores de crecimiento y facilita a aquellos microorganismos que tienen mayores requerimientos nutricionales a crecer. Además, el medio de cultivo nos proporciona información sobre la patogenicidad del microbio en base a la hemólisis producida en el mismo.

La zona orofaríngea es colonizada a las pocas horas del nacimiento y a partir de ese momento se va conformando lo que será la microbiota de la boca, orofaringe y nasofaringe que nos caracterizará a cada uno de nosotros. Esto es debido a que, al igual que la microbiota intestinal, ésta también depende de la situación ambiental de cada individuo y no existen dos personas con el mismo conjunto de microorganismos en la microbiota.

Además, esta microbiota es relativamente estable a lo largo del tiempo, aunque puede variar dependiendo del estado de la misma. Si hay enfermedades como gingivitis, periodontitis, alveolitis o la pérdida o extracción de piezas dentales se puede alterar la composición de la misma. También puede alterarla los alimentos ingeridos, los tóxicos inhalados (como el tabaco) o la deficiente higiene bucal.

Los principales microorganismos que podemos encontrar en la orofaringe son los siguientes:

• Haemophilus spp.

• Corynebacterium spp.

• Neisseria spp.

• Streptococcus pyogenes

• Streptococcus viridans

Además, al tomar las muestras de lo que se presupone un individuo sano, no se espera obtener ninguna colonia bacteriana con beta-hemólisis, por lo que se tomará una muestra adicional cutánea de la mano para intentar observar algún microorganismo beta-hemolítico.

Por último, haremos una tinción de Gram para poder observar de forma más clara y poder discernir más fácilmente entre los tipos de bacterias que pueden crecer.

2. Objetivos

1. Obtención de muestras de la orofaringe y cutáneas sin contaminación.

2. Siembra directa con hisopo y mediante dilución en agua en agar sangre.

3. Interpretación de los resultados de la siembra.

4. Elección y extensión de microorganismos alfa, beta y gamma hemolíticos.

5. Realización de la tinción de Gram.

6. Estudio al microscopio e identificación de los microorganismos.

3. Materiales

1. Fungibles

1. 1. Reutilizables

• Asa de siembra con mango de Kolle

• Gradilla

• Puente de tinción

• Cristalizador

• Frasco lavador

• Mechero de alcohol y mechero para encenderlo

• Asa de Drigalsky

• Rotulador permanente

• Pinza de laboratorio

2. Desechables

• Puntas de pipeta

• Papel de filtro

• 3 placas de Agar sangre Columbia con sangre de carnero [Ficha técnica]

• 3 portaobjetos

• 4 pipetas Pasteur

• Tubo Falcon de 15 mL

• Mascarilla quirúrgica

• Hisopos estériles

• EPIs necesarios (bata, guantes, gafas)

2. Inventariables

• Micropipetas

• Mechero Bunsen

• Estufa

• Microscopio óptico

3. Reactivos

• Agua destilada estéril

• Agua destilada

• Cristal violeta

• Lugol

• Decolorante de Gram (alcohol-acetona al 30%)

• Safranina

• Aceite de inmersión

4. Modus operandi 

4.1 Preparación de los materiales

Esta práctica está preparada para realizarse en dos días distintos, por lo que vamos a tener varias estaciones de trabajo en diferentes lugares y preparadas en distintos momentos.

En nuestro caso, tendremos:

• Una zona cercana a los mecheros Bunsen donde se tomará la muestra y se sembrarán el hisopo de la misma.

• Una zona en la mesa de trabajo donde se realizará la elección de las colonias y la extensión de las mismas en portaobjetos.

• Una zona en la mesa de trabajo donde realizaremos la tinción de Gram.

• Una zona en la mesa de trabajo donde realizaremos la observación al microscopio.

Como podemos observar en las figuras 1 y 3, ya se tienen ciertos reactivos en botes o tubos con la cantidad necesaria. Esto lo realizamos de esta manera para facilitarnos el trabajo posteriormente.

4.2 Preparación de los materiales

Antes de proceder con la toma de la muestra, deberemos preparar un tubo Falcon con 3 mL de agua destilada estéril. Para ello, tomaremos agua destilada estéril del bote de vidrio de agua destilada estéril (previamente esterilizado en el autoclave) y lo dispensamos en la zona estéril del mechero Bunsen (15 cm alrededor del mismo).

A continuación, pasaremos a rotular las tres placas de agar sangre con el identificador del grupo (G2) y el tipo de muestra  que es. En nuestro caso:

• Muestra orofaríngea directa

• Muestra orofaríngea diluida

• Muestra cutánea

4.3 Preparación de los materiales

Con esto, ya tendríamos la primera muestra lista. Ahora tomamos una segunda muestra también del paladar blando del mismo compañero de nuevo con un hisopo estéril pero en este caso deberemos realizar un paso previo a la siembra.

En este caso, al tomar la muestra, se sumergirá el hisopo en los 3 mL de agua destilada esteril rotando el mismo sobre las paredes del tubo Falcon y removiendo. Después lo dejaremos 30 segundos dentro del tubo antes de retirarlo y depositarlo en el contenedor apropiado.

La siembra también se ve modificada, ya que en este caso la muestra de la que disponemos ahora está en un medio líquido. Por esta razón tendremos que hacer uso de la micropipeta para dispensar un volumen de 100 μL sobre la placa de agar sangre. Para extenderla por toda la placa, deberemos hacer uso del asa de Drigalsky hasta que el inóculo quede repartido por toda la superficie de la placa y se haya absorbido por completo. Para concluir, cerramos la placa con la tapa e invertimos la placa apilándola sobre la anterior.

Para la toma de la última muestra deberemos quitar el guante de alguno de nuestros compañeros y tomar el inóculo de la palma de la mano con un hisopo estéril frotando sobre la misma en varias direcciones.

A la hora de realizar la siembra, hay que tener en cuenta que el hisopo estará mayoritariamente seco, por lo que habrá que ser extremadamente cuidadoso, ya que puede atascarse en el recorrido y arrancar parte del medio.

4.4 Incubación en la estufa

Una vez realizadas todas las siembras, pasaremos a la incubación de las placas en la estufa a 37 ºC durante unas 24 horas o hasta observar crecimiento en las placas.

Puede que tras la incubación observemos las placas más oscurecidas o incluso similares a las de agar chocolate, pero esto es debido a la alfa-hemólisis de las colonias bacterianas.

4.5 Selección y extensión de las colonias microbianas

Para la selección de las colonias deberemos tener en cuenta lo siguiente:

• Las colonias alfa-hemolíticas tienen un halo verdoso a su alrededor.

• Las colonias beta-hemolíticas tienen un halo amarillento o transparente a su alrededor.

• Las colonias gamma-hemolíticas no tienen halo a su alrededor.

Para poder observarlas de forma clara, debemos hacerlo sobre una fuente de luz y ahí detectar o no la presencia de hemólisis en el medio.

En nuestro caso y pese a ser un cultivo mixto, como hemos observado en las figuras 15, 16 y 17, hemos sido capaces de extraer de forma casi totalmente aisladas colonias para su posterior observación.

Una vez seleccionadas las colonias, encendemos el mechero de alcohol y procedemos a realizar la extensión en portaobjetos y su fijación por calor, para ello:

1. Se rotulará el portaobjetos con el tipo de microorganismo de esa extensión (α, β o γ).

2. Se añade una gota de agua destilada en el centro del portaobjetos.

3. Se esteriliza el asa de siembra en el mechero de alcohol al igual que hacemos en el mechero Bunsen.

4. Se espera hasta que el asa de siembra se atempere y no se produzca la inutilización de la colonia seleccionada.

5. Se toma la colonia con el asa de siembra, se deposita sobre la gota de agua y se realiza la extensión sobre el portaobjetos.

Ahora solo quedaría fijar las bacterias de la colonia al portaobjetos por calor, para ello:

1. Con suma delicadeza, se toma el portaobjetos y se amarra a la pinza de laboratorio.

2. Con mucho cuidado y sin que se caliente excesivamente el portaobjetos, se sitúa encima de la llama del mechero de alcohol.

3. Sin que llegue a calentarse como para quemar, se retira y se sitúa encima de la mano para comprobar la temperatura.

   1. Si quema mucho, se deberá esperar a que enfríe antes de volver a situarlo sobre la llama.

   2. Si está templado, esperaremos a que se enfríe ligeramente antes de volver a calentar.

   3. Si sigue frío, se puede volver a poner sobre la llama del mechero.

4. Es importante tener en cuenta que si se calienta demasiado posteriormente al realizar la tinción Gram se observen todas como Gram- debido a que se ha alterado la estructura de la bacteria.

5. Deberemos repetir este procedimiento hasta que se observe la extensión de un color blanquecino y totalmente seca.

Este proceso lo deberemos repetir para aquellas colonias microbianas que se quieran teñir para su posterior observación al microscopio.

4.6 Tinción de Gram

Para la realización de la tinción de Gram, serán necesarios cuatro reactivos, como se ha indicado anteriormente: cristal violeta, lugol, decolorante de Gram y safranina). Es muy importante la correcta medida de los tiempos, especialmente con el decolorante para su correcta observación. El procedimiento es el siguiente:

1. Se vierte un poco de agua sobre el cristalizador para prevenir la tinción del mismo.

2. Se coloca el puente de tinción sobre el cristalizador.

3. Se colocan las muestras sobre el puente de tinción.

4. Se cubren las muestras con el colorante primario (cristal violeta) y se deja actuar durante 60 segundos.

5. Verter el colorante y realizar lavados con agua destilada hasta retirar el exceso de colorante.

6. Se cubren las muestras con el mordiente (lugol) y se deja actuar durante 60 segundos.

7. Verter el mordiente y realizar lavados con el frasco lavador hasta retirar el exceso de mordiente.

8. Se cubren las muestras, de forma individual para controlar bien los tiempos, con el decolorante de Gram y se deja actuar durante 30 segundos.

9. Verter el exceso de decolorante y realizar lavados con el frasco lavador hasta retirar el exceso de decolorante. Es conveniente lavar bien, ya que el decolorante es hidrófobo.

10. Se cubren las muestras con el colorante de contraste (safranina) y se deja actuar durante 60 segundos.

11. Verter el exceso de colorante y realizar lavados con el frasco lavador hasta retirar el exceso de colorante.

Con esto, solo quedaría dejar secar totalmente la muestra para su posterior observación al microscopio.

Es posible que al añadir los reactivos y los consecuentes lavados se borren el identificador si se ha escrito con un rotulador permanente o bolígrafo. Se recomienda hacer uso de un lápiz de grafito.

4.7 Observación al microscopio

Para la observación al microscopio se deberá realizar una calibración del mismo como se ha realizado con anterioridad y realizar una limpieza tanto de los oculares como de las lentes.

A continuación, se pondrá el portaobjetos sobre la platina y se enfocará con el macrométrico y posteriormente con el micrométrico hasta observar la muestra. Se continuará con los objetivos de 10X, 40X y para el de 100X se añadirá una gota de aceite de inmersión.

5. Resultados

Hemos observado agrupaciones bacterianas y la interpretación que podemos hacer de la identificación es la siguiente:

6. Conclusiones

Hemos podido realizar con facilidad los diferentes procedimientos llevados a cabo en la práctica. Además, hemos podido comprobar que:

• Hay que tener especial cuidado a la hora de sembrar la muestra cutánea ya que el hisopo no se encuentra húmedo por lo que es fácil romper el medio.

• Es importante fijar las bacterias por calor. Sin embargo, no se debe calentar demasiado la muestra ya que podría afectar tanto a la tinción como a la morfología bacteriana.

• Es importante tener en cuenta los tiempos a la hora de realizar la tinción de Gram para no alterar los resultados.

• La identificación presuntiva es un tanto compleja ya que la valoración es a través de un cultivo mixto y no de un cultivo puro, el cual nos asegura que hayan colonias de un microorganismo en cuestión.

• No se han realizado pruebas bioquímicas (exceptuando la prueba de las hemolisinas), por lo que solo se puede hacer una ligera aproximación.

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