ELISA cuantitativo (Grupo 2)

La técnica ELISA (análisis de inmunoadsorción ligados a enzimas o el acrónimo de Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay en inglés) es un ensayo que utiliza antígenos o anticuerpos marcados con una enzima e insolubilizados sobre un soporte. De esta forma, la reacción antígeno anticuerpo queda inmovilizada en el soporte y puede ser revelada fácilmente añadiendo un sustrato específico, que será usado por la enzima para producir un color que puede ser observado a simple vista o cuantificado por un espectrofotómetro.

En nuestro caso, utilizaremos la modalidad de ELISA directo. Esta consiste en realizar el siguiente proceso:

1. Se adsorbe el antígeno de la muestra mediante diluciones seriadas en el caso de los antígenos A y B o con triple repetición para los antígenos desconocidos.

2. Se elimina la fracción de muestra no adsorbida al pocillo y se realizan dos lavados con tampón de lavado.

3. Se añaden los anticuerpos primarios A y B.

4. Se elimina la fracción de anticuerpos no unidos al antígeno y se realizan dos lavados.

5. Se añaden los anticuerpos secundarios unidos a la enzima HRP.

6. Se elimina la fracción de anticuerpos secundarios (o anti-anticuerpos) no unidos al anticuerpo primario y se realizan dos lavados.

7. Se añade el sustrato y tras una incubación de entre 2 y 5 minutos se añade la solución de STOP.

8. Se realiza una fotografía para el posterior análisis de los resultados.

Con esto, podremos observar la presencia (o no) de los antígenos específicos en la muestra para los que hemos preparado el ensayo. En nuestro caso, si es positivo lo observaremos de un color verde aguamarina, si es negativo lo observaremos de un color transparente o ligeramente azulado.

2. Objetivos

1. Realización de un ELISA, concretamente la variante directa.

2. Correcta dispensación de los diferentes reactivos conociendo que hace cada uno de ellos y cómo interactúan entre ellos.

3. Revelado e interpretación de los resultados del inmunoensayo.

3. Materiales

3. 1. Fungibles

      1. Reutilizables

• Gradilla

• Vaso de precipitados

• Rotulador permanente

2. Desechables

• Puntas de pipeta

• Papel de filtro

• Pipeta Pasteur

• 2 placas de microtitulación

• 10 tubos Eppendorf

• Guantes desechables de laboratorio

• Papel

2. Inventariables

• Micropipetas

• Gradilla para microtubos

3. Reactivos

• Agua destilada

• Tampón de lavado

• 1 tubo Eppendorf de 0,5 mL de antígeno A (A1)

• 1 tubo Eppendorf de 0,5 mL de antígeno B (B1)

• 2 tubos Eppendorf de 0,5 mL de antígeno desconocido 1 (D1)

• 2 tubos Eppendorf de 0,5 mL de antígeno desconocido 2 (D2)

• 2 tubos Eppendorf de 1,5 mL de anticuerpo primario A (AbA)

• 2 tubos Eppendorf de 1,5 mL de anticuerpo primario B (AbB)

• 2 tubos Eppendorf de 1,5 mL de anticuerpo secundario (2AB)

• 2 tubos Eppendorf de 1,5 mL de sustrato ABTS

• 2 tubos Eppendorf de 1,5 mL de solución STOP

• 2 tubos Eppendorf de 1,5 mL de tampón de dilución (TD)

4. Modus operandi

4.1.Preparación de los materiales

Lo primero que tenemos que hacer es preparar los materiales necesarios para realizar la práctica, indicados anteriormente. Lo que deberemos tener en primer lugar será:

• Gradilla de tubos Eppendorf

• Tubos Eppendorf proporcionados por el profesor responsable

• 10 tubos Eppendorf de 0,5 mL vacíos

• 2 placas de microtitulación

• Pipeta de 20-200 μL

• Puntas de pipeta

• Papel de filtro

• Papel absorbente

Antes de comenzar a realizar la práctica deberemos rotular las placas de microtitulación para indicar las columnas (1, 2 y 3), una línea divisoria entre las filas 6 y 7 y añadir la letra A y B a cada una de las placas, quedando como en la figura 1.

Ahora, deberemos rotular los tubos de 0,5 mL con los que posteriormente realizaremos las diluciones, 5 de ellos con A2-A6 y los otros 5 con B2-B6.

Por último, llenaremos el vaso de precipitados con solución de lavado.

4.2. Diluciones seriadas

Para poder obtener un patrón, deberemos realizar una dilución seriada de las proteínas estándar, es decir, de los antígenos A y B (A1 y B1).

Para ello realizaremos el siguiente proceso: 

1. Deberemos trasvasar 150 μL de tampón de dilución (TD) cada uno de los tubos (A2-A6).

2. Tomamos 50 μL del tubo A1 y lo transferimos al tubo A2.

3. Realizamos una homogeneización por pipeteos sucesivos.

4. Tomamos 50 μL del tubo A2 y lo transferimos al tubo A3.

5. Realizamos una homogeneización por pipeteos sucesivos.

6. Repetimos el proceso hasta el A6.

7. Tomamos 50 μL del tubo A6 y los desechamos.

Con ello, habremos realizado una dilución seriada de 1:4 en cada uno de los tubos, obteniendo un volumen de 150 μL en cada uno de los tubos A.

Por último, deberemos realizar el mismo procedimiento pero con el tubo B1 y los tubos B2-B6.

4.3. Inmovilización de antígenos

Ahora deberemos trasvasar el contenido de cada uno de los tubos a su correspondiente lugar en la placa de microtitulación, en este caso:

1. Añadimos 50 μL del tubo A1 al pocillo de la primera columna y primera fila, tanto de la placa A como de la placa B.

2. Añadimos 50 μL del tubo A2 al pocillo de la primera columna y segunda fila, tanto de la placa A como de la placa B.

3. Repetimos hasta haber terminado con el A6.

4. Añadimos 50 μL del tubo B1 al pocillo de la segunda columna y primera fila, tanto de la placa A como de la placa B.

5. Añadimos 50 μL del tubo B2 al pocillo de la segunda columna y segunda fila, tanto de la placa A como de la placa B.

6. Repetimos hasta haber terminado con el B6.

7. Añadimos 50 μL del tubo D1 a los tres primeros pocillos de la columna 3 tanto de la placa A como de la placa B.

8. Añadimos 50 μL del tubo D2 a los tres siguientes pocillos de la columna 3 tanto de la placa A como de la placa B.

A continuación, deberemos incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente y posteriormente invertir la placa sobre el papel absorbente golpeando la placa suavemente para que vierta el contenido de los pocillos.

Posteriormente deberemos realizar dos lavados. Cada uno de ellos se realiza de la siguiente manera:

1. Llenamos con la pipeta Pasteur los pocillos de la placa A con solución de lavado sin llegar a rebosarlos.

2. En cuanto los tenemos, invertimos la placa sobre el papel absorbente y golpeamos suavemente para vaciar los pocillos de la placa A.

3. Repetimos el proceso con la placa B.

Es importante ser cuidadoso a la hora de derramar el contenido de los pocillos, ya que se puede producir contaminación cruzada.

4.4. Adición de los anticuerpos primarios y secundarios

Una vez finalizados los lavados del anterior paso, deberemos añadir el anticuerpo primario, que es el específico para ese antígeno que ha sido adsorbido a la pared del pocillo. Para ello:

1. Añadimos 50 μL del tubo AbA a cada uno de los pocillos de la placa A.

2. Ponemos una cuenta atrás para que nos notifique tras el paso de 5 minutos.

3. Añadimos 50 μL del tubo AbB a cada uno de los pocillos de la placa B.

4. Ponemos otra cuenta atrás para que nos notifique tras el paso de 5 minutos.

5. Tras la notificación de la primera alarma, volcamos la placa A y la golpeamos suavemente para que vierta el contenido de la misma.

6. Hacemos lo mismo con la segunda alarma para la placa B.

7. Realizamos dos lavados como se ha mencionado anteriormente, tanto de la placa A como de la placa B.

Para añadir el anticuerpo secundario que tiene enlazada la enzima peroxidasa de rábano (HRP por su acrónimo en inglés), que se unirá al anticuerpo primario. Como son válidos tanto para el anticuerpo A como para el anticuerpo B, el contenido del tubo 2AB podremos usarlo de forma indistinta en la placa A como en la placa B. Para añadir el anticuerpo secundario, seguiremos el siguiente proceso:

1. Añadimos 50 μL del tubo 2AB a cada uno de los pocillos de la placa A.

2. Ponemos una cuenta atrás para que nos notifique tras el paso de 5 minutos.

3. Añadimos 50 μL del tubo 2AB a cada uno de los pocillos de la placa B.

4. Ponemos otra cuenta atrás para que nos notifique tras el paso de 5 minutos.

5. Tras la notificación de la primera alarma, volcamos la placa A y la golpeamos suavemente para que vierta el contenido de la misma.

6. Hacemos lo mismo con la segunda alarma para la placa B.

7. Realizamos dos lavados como se ha mencionado anteriormente, tanto de la placa A como de la placa B.

4.5. Adición del sustrato

A continuación, y para revelar el resultado del ELISA, deberemos añadir la solución de ABTS, que es el específico para ese antígeno que ha sido adsorbido a la pared del pocillo. Para ello:

1. Añadimos 50 μL del tubo ABTS a cada uno de los pocillos de la placa A.

2. Ponemos una cuenta atrás para que nos notifique tras el paso de 5 minutos.

3. Añadimos 50 μL del tubo ABTS a cada uno de los pocillos de la placa B.

4. Ponemos otra cuenta atrás para que nos notifique tras el paso de 5 minutos.

5. Tras la notificación de la primera alarma, añadimos 50 μL del tubo STOP.

6. Hacemos lo mismo con la segunda alarma para la placa B.

Con esto, deberemos haber obtenido un gradiente de concentraciones en la columna 1 de la placa A y en la columna 2 de la placa B. Además, se deberán de ver con un color intenso los tres primeros pocillos de la columna 3 de la placa A y los 3 últimos pocillos de la columna 3 de la placa B. Algo similar a lo siguiente:

En nuestro caso, hemos obtenido un resultado diferente en el B pero es debido a que teníamos menos cantidad de solución de revelado (ABTS) y tuvimos que usar 30 μL en cada uno de los pocillos del B para que todos los pocillos tuviesen cantidad suficiente.

5. Resultado

5.1. GIMP

Se ha usado la siguiente imagen para el análisis de los resultados:

Tras seguir el proceso indicado para obtener los valores medios de los píxeles, hemos obtenido los siguientes valores para la placa de microtitulación A:

Hemos realizado el mismo proceso pero en este caso con la placa B:

Con ello hemos obtenido los siguientes gráficos con sus respectivas líneas de tendencia:

De ambas gráficas hemos obtenido una función logarítmica, que era la que mejor se ajustaba al R2 (0,888 y 0,95 respectivamente).

• Antígeno A: y=0,361+0,0331 ln(x) 

• Antígeno B: y= 0,323+0,011 ln(x)

Dado que la X es la concentración de antígenos (μg/mL) y la Y es el valor medio de los píxeles, deberemos despejar la X para la obtención de el valor de concentración preciso para un valor medio de píxeles dado:

• Antígeno A: x= e(y-0,361)/0,0331

• Antígeno B: x= e(y-0,323)/0,011

Con lo que sustituyendo los resultados en la función anterior, obtenemos los siguientes resultados:

5.2. ImageJ

Se ha usado la misma imagen que para su cuantificación mediante GIMP, es decir, la figura 29. 

Tras seguir el proceso indicado en el protocolo para obtener los valores medios de los píxeles, hemos obtenido los siguientes valores para la placa de microtitulación A:

Siguiendo el mismo proceso con la placa de microtitulación, hemos obtenido los siguientes valores:

Con ello hemos obtenido los siguientes gráficos con sus respectivas líneas de tendencia:

De ambas gráficas hemos obtenido una función logarítmica, que era la que mejor se ajustaba al R2 (0,906 y 0,928 respectivamente).

• Antígeno A: y=94,3+9,16 ln(x)

• Antígeno B: y= 86,4+2,35 ln(x)

Dado que la X es la concentración de antígenos (μg/mL) y la Y es el valor medio de los píxeles, deberemos despejar la X para la obtención de el valor de concentración preciso para un valor medio de píxeles dado:

• Antígeno A: x= e^(y-94,3)/9,16

• Antígeno B: x= e^(y-86,4)/2,35

Con lo que sustituyendo los resultados en la función anterior, obtenemos los siguientes resultados:

Si aplicamos el factor corrector a los resultados de la placa B, obtenemos los siguientes resultados estimativos:

6. Conclusiones

Los resultados obtenidos en la placa A son congruentes con lo que deberíamos esperar ya que el patrón se observa como un gradiente de concentraciones en la columna 1 y la muestra problema 1 (D1) es la mayoritaria en los tres primeros pocillos de la columna 3.

Por otra parte, en la placa B los resultados no son tan satisfactorios. Esto es debido a que no se disponía de suficiente ABTS para repartir a todos los pocillos de esta placa, por lo que el color producido ha sido mucho menor y es menos distinguible a simple vista. En los resultados numéricos obtenidos sí que se observa esa pequeña diferencia, pero las concentraciones se han visto alteradas, de ahí la creación de una nueva tabla de resultados estimativos.

Por último, comentar que se han cumplido los objetivos que se marcaban en la práctica a falta de comprobación de los resultados por parte del profesor responsable de la práctica.

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