Tinción Giemsa
Tinción Giemsa
Grupo 2
Ana Isabel Arroyo Gil, Álvaro Crespo Cardoso, Javier Fernández Delgado, Raúl Gragera Traver, Luis Miguel Lavado Gómez
Docente: Mercedes Pumariño Almoril
1. Introducción
La tinción Giemsa es un tipo de tinción convencional policroma, es decir, es un tipo de tinción hematológica que utiliza combinaciones de colorantes con distintas afinidades para que las estructuras celulares (citoplasma, núcleo, gránulos, orgánulos) se tiñan con colores diferentes. Pueden realizarse tanto en sangre periférica como en médula ósea.
La tinción Giemsa deriva de la tinción Romanowsky, que se basa en el uso de colorantes catiónicos, como es el azul de metileno o sus derivados (azur I y azur II) y de colorantes aniónicos, como es la eosina. En concreto, la tinción Giemsa se basa en el uso de eosina como colorante ácido y derivados del azul de metileno (azur I y azur II) como colorante básico.
De este modo, las estructuras celulares cargadas negativamente, como los ácidos nucleicos, se teñirán de un color azul y aquellas estructuras celulares cargadas positivamente, como los gránulos de los eosinófilos, se teñirán con matices de color rojo.
2. Objetivos
Preparación de un frotis sanguíneo mediante la técnica del portaobjetos en cuña.
Fijación de la muestra y tinción con Giemsa.
Visualización e identificación al microscopio de los elementos formes de la sangre.
3. Materiales
Fungibles
Reutilizables
Puente de tinción
Cristalizador
Pipetas
Propipeta o auxiliar de pipeteo
Frasco lavador
Gradilla
Tubo de ensayo
Desechables
Portaobjetos
Puntas de pipeta
Papel de filtro
Bote de boca ancha
Pipeta Pasteur
Inventariables
Micropipetas
Microscopio óptico
Reactivos
Metanol
Solución Giemsa
Agua destilada
4. Modus operandi
4.1. Preparación de los materiales
Lo primero que vamos a hacer es recopilar todos los materiales que vamos a necesitar para esta práctica. Estos son los materiales esenciales:
Figura 1. Materiales usados en la práctica
Además de estos materiales, podremos hacer uso de otros como pipetas y micropipetas de diferentes volúmenes, según necesitemos.
4.2. Realización del frotis
Figura 2. Movimiento de inversión del tubo
Para la realización del frotis haremos uso de sangre anticoagulada con EDTA procedente del Banco de Sangre del Servicio Extremeño de Salud.
También se podría hacer con sangre obtenida mediante punción en el pulpejo y uso de capilares de vidrio o directamente sobre el portaobjetos.
Antes de extraer la sangre del tubo, deberemos homogeneizar la muestra mediante movimientos de inversión con delicadeza (figura 2), ya que podríamos hemolizar la muestra y observaríamos eritrocitos lisados. Si la muestra ha sido refrigerada, deberá atemperarse antes de proceder con el frotis.
Una vez tenemos preparada la muestra, escogeremos dos portaobjetos que deben haberse limpiado para evitar la presencia de artefactos o gotículas de grasa y escogeremos uno para usar de extensor que deberá tener los bordes biselados y otro para usar de soporte, que es donde quedará extendida la muestra.
Figura 3. Muestra previamente homogeneizada en la parte inferior, portaobjetos extensor a la izquierda y portaobjetos soporte a la derecha
A continuación, cogeremos una micropipeta de 1-10 μL y unas puntas de pipeta acordes. Regulamos el dial a 5-10 μL y cogemos ese volumen de muestra (figura 4).
Ahora lo depositaremos en el tercio superior del portaobjetos soporte, para hacer una extensión larga y uniforme (figura 5).
Es importante que desechemos las puntas de pipeta en el contenedor rígido amarillo para cortopunzantes (figura 6).
Por último haremos la extensión propiamente dicha, para ello vamos a seguir los siguientes pasos:
Colocamos el portaobjetos extensor sobre el portaobjetos soporte por delante de la gota de sangre formando un ángulo de 45º aproximadamente (figura 7).
Deslizamos el portaobjetos extensor hacia atrás hasta que el borde toque la gota de sangre (figura 8).
Esperar a que la gota se distribuya por capilaridad a lo largo del extremo del portaobjetos extensor (figura 9).
Deslizar el portaobjetos extensor hacia delante con un movimiento rápido, suave y uniforme (figura 10).
Dejamos secar la extensión (figura 11).
Figura 4. Extracción de la sangre desde el tubo de EDTA
Figura 5. Gota de sangre sobre el portaobjetos soporte
Figura 6. Eliminación de la punta de pipeta en el contenedor rígido amarillo (cortopunzantes)
Figura 7. Portaobjetos extensor deslizándose hacia atrás para tocar la gota de sangre con un ángulo de 45º
Figura 8. Portaobjetos extensor tocando la gota de sangre
Figura 9. Portaobjetos extensor con todo el borde cubierto de sangre por capilaridad
Figura 10. Extensión hacia delante del portaobjetos extensor y forma de la extensión final
Figura 11. Extensiones en vertical secándose
4.3. Preparación de la solución Giemsa
Para la preparación de la solución de Giemsa, el centro ha adquirido el reactivo Giemsa solución de la marca Bio-Optica. Podemos revisar la Ficha de Datos de Seguridad (FDS) en este enlace. Para revisar la dilución que tenemos que realizar, deberemos revisar la ficha de datos que nos ofrece la empresa proveedora.
En ella se nos indica que deberemos hacer una dilución 1:10 (1 parte de Giemsa + 9 partes de agua destilada).
En nuestro caso, vamos a hacer 10 ml de solución de Giemsa, por lo que deberemos realizar una dilución de 1 ml de Giemsa y 9 ml de agua destilada. Para ello vamos a utilizar una pipeta de 1 ml, una pipeta de 10 ml, la pera de goma (propipeta) y una pipeta Pasteur. También podríamos hacer uso de una micropipeta para coger 1 ml de Giemsa.
Realizamos el siguiente procedimiento:
Acoplamos la pera de goma a la pipeta de 1 ml y enrasamos a 0, ya que es una pipeta graduada de tipo 1 o vaciado parcial (figura 12).
Vertemos el contenido de la pipeta en el tubo de ensayo (figura 13).
Desacoplar la pera de goma de la pipeta de 1 ml y la acoplamos a la pipeta de 10ml.
Enrasamos a 1 ml para medir un volumen de 9 ml, ya que, a pesar de ser también una pipeta graduada de tipo 1, haremos uso de ella como si fuese una de tipo 2, ya que haremos un vaciado total (figura 14).
Vertemos el contenido de la pipeta en el tubo de ensayo (figura 15).
Resuspendemos entre 10 y 20 veces el contenido del tubo de ensayo con la pipeta Pasteur para homogeneizar la dilución.
Figura 12. Enrasado de 1ml de reactivo Giemsa
Figura 13. Vertido del reactivo Giemsa en el tubo de ensayo
Figura 14. Enrasado de 9ml de agua destilada
Figura 15. Vertido del agua destilada en el tubo de ensayo
4.4. Fijación de la muestra
Figura 16. Metanol puro de 5L
Para la fijación de la muestra haremos uso del puente de tinción, el cristalizador, una pipeta Pasteur y metanol puro (figura 16).
El metanol puro es un reactivo muy inflamable que debe usarse con sumo cuidado y evitar ser inhalado. La FDS puede revisarse en este enlace.
Utilizaremos un bote de boca ancha con tapón de rosca para introducir unos 50 ml de metanol y hacer uso de él.
Ahora pondremos el puente de tinción sobre el cristalizador y pondremos los portaobjetos con las extensiones sobre él (figura 17). A continuación, cubriremos por completo los frotis sanguíneos con el metanol con la pipeta Pasteur (figura 18).
Tras esperar 3 minutos, retiramos el excedente de metanol, escurrimos y dejamos secar al aire (figuras 19 y 20). Es importante dejar secar totalmente ya que si no lo hacemos, la extensión puede no fijarse correctamente y desprenderse.
Figura 17. Colocación del puente de tinción sobre el cristalizador y los portaobjetos sobre el puente de tinción. El cristalizador tiene agua en el fondo para que no tome el colorante de la solución Giemsa
Figura 18. Portaobjetos siendo cubiertos con metanol con una pipeta Pasteur
Figura 19. Portaobjetos siendo escurridos tras el tiempo de acción del metanol
Figura 20. Portaobjetos colocados de forma vertical para secarse
4.5. Tinción de la muestra
Tras comprobar que las extensiones están perfectamente secas, las volveremos a poner sobre el puente de tinción, esta vez para teñirlas con la solución de Giemsa.
Ahora volveremos a cubrir las extensiones sanguíneas con Giemsa y haciendo uso de una pipeta Pasteur o reutilizando la que hemos utilizado para resuspender la disolución (figuras 21 y 22).
Pasados 25 minutos¹, escurrimos el exceso de colorante, lavamos las extensiones con agua destilada y dejamos secar por completo (figuras 23 y 24 respectivamente).
Aunque en el protocolo del fabricante nos indica que deben ser 15 minutos, esto es con una tinción previa con May Grünwald. En nuestro caso solo vamos a realizar una tinción Giemsa, no May Grünwald-Giemsa, por lo que hemos tenido que modificar estos tiempos a los tiempos estandarizados.
Figura 21. Extensiones siendo cubiertas con la solución de Giemsa haciendo uso de una pipeta Pasteur
Figura 22. Extensiones cubiertas con Giemsa
Figura 23. Extensiones siendo escurridas y lavadas con el frasco lavador con agua destilada
Figura 24. Extensiones en posición vertical para secarse
4.6. Finalización de la práctica
Figura 25. Bidón de 25L
Tras terminar de lavar las extensiones y mientras se secan, deberemos lavar y recoger los materiales usados.
Tenemos que tener en cuenta que el líquido que queda en el cristalizador es un desecho peligroso por lo que debemos desecharlo tal y como indica el fabricante. Concretamente deberemos guardarlos en garrafas de plástico rígido hasta que pueda ser recogido por la empresa especializada autorizada. En nuestro caso es una garrafa de 25 L (figura 25).
5. Resultados
Tras tener las extensiones teñidas con Giemsa y secadas, pasaremos a su observación al microscopio. En nuestro caso hemos observado que la sangre de la que hemos hecho las extensiones presentaba un coágulo, por lo que se puede prever que no vamos a encontrar muchas células fagocíticas como monocitos y neutrófilos.
En la descripción de cada una de las figuras, aparecerán una descripción general de la imagen, las células que hemos observado y el objetivo utilizado.
Figura 26. Imagen obtenida con objetivo de 40X
Se pueden observar gran cantidad de eritrocitos distribuidos de forma más o menos uniforme y con formas y tamaños bastante homogéneos, aunque se observan algunos espiculados. Se pueden observar también por toda la imagen cuantiosas plaquetas con diversos tamaños (anisotrombia). Con respecto a la célula coloreada de púrpura, podríamos decir que es un linfocito.
Figura 27. Imagen obtenida con objetivo de 40X
Esta imagen ha sido tomada de la parte entre la cabeza y el cuerpo de la extensión, por eso se pueden observar los hematíes muy cercanos entre sí. Las plaquetas sí que tienen un tamaño más uniforme que en la figura 26. En la imagen se pueden observar dos células muy definidas y el citoplasma de otra de ellas que puede haber sido destruida. Con respecto a la célula que se encuentra en el cuatrante superior derecho (que tiene el núcleo teñido de color púrpura muy oscuro casi negro) podemos decir que es un linfocito. Sin embargo la célula ubicada en la parte central izquierda, podemos decir que es un monocito.
Figura 28. Imagen obtenida con objetivo de 40X
Esta imagen ha sido tomada, al igual que la anterior, en la zona entre la cabeza y el cuerpo de la extensión. Se pueden observar plaquetas de un tamaño más o menos homogéneo y tres células de la serie blanca. Dos de ellas son linfocitos (las dos más superiores) y la otra es un monocito (la ubicada en la parte más inferior). Se observa también lo que parece ser restos del citoplasma de una célula.
Figura 29. Imagen obtenida con objetivo de 40X
Esta imagen, al igual que la primera (figura 26) ha sido tomada del cuerpo de la extensión. Tiene una distribución eritrocitaria más o menos homogénea pero muchos de ellos están espiculados. Las plaquetas tienen un tamaño más o menos homogéneo.
En la parte central baja se puede observar los restos de una célula que ha colapsado probablemente al realizar el frotis.
Figura 30. Imagen obtenida con objetivo de 40X
Esta imagen ha sido tomada en la zona entre la cabeza y el cuerpo de la extensión por lo que los eritrocitos se encuentran muy juntos entre sí. Se pueden observar plaquetas de un tamaño relativamente grande y dos células de la serie blanca. Ambas parecen ser linfocitos y la inferior parece que tiene el núcleo desviado por lo que ha debido reventar en el proceso de extensión.
Figura 31. Imagen obtenida con objetivo de 100X y aceite de inmersión
Imagen en la que se observan restos celulares de una célula de la serie blanca indeterminada (pero muy distinta a una mancha de Gumprecht). Los eritrocitos tienen un tamaño más o menos uniforme. En la parte lateral izquierda se observan eritrocitos totalmente lisados.
Figura 32. Imagen obtenida con objetivo de 40X
Esta imagen ha sido tomada en la zona entre la cabeza y el cuerpo de la extensión por lo que los eritrocitos se observan muy unidos entre sí. Las plaquetas observadas tienen un tamaño más o menos uniforme. En el centro se puede observar de forma muy clara lo que parece ser un monocito.
Figura 33. Imagen obtenida con objetivo de 100X y aceite de inmersión
Es el mismo cuadrante que la imagen anterior pero con el objetivo de 100X para observar mejor el monocito. Al cambiar el objetivo se puede apreciar la separación entre los eritrocitos aunque sigue siendo escasa. Las plaquetas se observan de una forma más o menos redondeadas. El monocito se observa muy definido con un núcleo de color púrpura oscuro y el citoplasma de un color azul violáceo.
Figura 34. Imagen obtenida con objetivo de 100X y aceite de inmersión
En esta imagen se puede observar que los eritrocitos centrales y de la zona izquierda están espiculados. Se observan también algunas plaquetas y en la zona central izquierda se observa una célula de la serie blanca aunque no está muy bien definida. Podría ser un monocito cuyo citoplasma no ha tomado mucha coloración, un linfocito con mucho citoplasma debido a su lisis o un neutrófilo hipersegmentado lisado
Figura 35. Imagen obtenida con objetivo de 100X y aceite de inmersión
En esta imagen se observan los eritrocitos espiculados y relativamente separados entre sí. Se observan plaquetas de una tamaño más o menos uniforme y en el cuadrante superior izquierdo un leucocito, concretamente lo que parece ser un linfocito.
Figura 36. Imagen obtenida con objetivo de 100X y aceite de inmersión
En esta imagen se observan los eritrocitos en Rouleaux. Se observan plaquetas de un tamaño más o menos uniforme.
En la parte central derecha se puede observar lo que parece ser un linfocito.
En la parte central izquierda se puede observar un neutrófilo con el núcleo dividido en tres segmentos. En este núcleo se puede observar perfectamente la unión de los tres fragmentos por fibras de cromatina.
Figura 37. Imagen obtenida con objetivo de 100X y aceite de inmersión
En esta imagen también se observan los eritrocitos en Rouleaux.
En el centro de la imagen se puede identificar una agregación plaquetaria de unas 25-30 plaquetas.
También se puede observar alguna plaqueta suelta, por ejemplo, en la esquina inferior derecha
Figura 38. Imagen obtenida con objetivo de 100X y aceite de inmersión
En esta imagen se observa de nuevo el fenómeno de pila de monedas en los eritrocitos.
Se observan también algunas plaquetas sueltas y una pequeña agregación plaquetaria en la parte inferior central.
Por último, en la zona central de la figura se observa un neutrófilo en cayado con el núcleo en forma de S.
Figura 39. Imagen obtenida con objetivo de 100X y aceite de inmersión
En esta imagen se ven los eritrocitos con forma espiculada pero con los bordes romos (equinocitos).
También se observan algunas plaquetas (8 aproximadamente)
En la zona central se puede identificar lo que parece ser un monocito de gran tamaño, con el núcleo ligeramente arriñonado y sin presencia aparente de vacuolas.
Figura 40. Imagen obtenida con objetivo de 100X y aceite de inmersión
Aquí volvemos a observar el fenómeno de Rouleaux y algunos de los eritrocitos son equinocitos.
Se observan algunas plaquetas aisladas pero sin agregación aparente.
Por último se observa lo que parece ser un linfocito con un núcleo muy definido.
Figura 41. Imagen obtenida con objetivo de 100X y aceite de inmersión
En esta figura se observan eritrocitos en pila de monedas muy concentradas.
Se observan también algunas plaquetas de diferente tamaño, aparentemente.
En la parte central se observa una célula con un núcleo bilobulado que puede ser un eosinófilo con una coloración alterada por el filtro utilizado para la observación al microscopio o un neutrófilo con la anomalía de Pelger-Huët. Sería necesario revisar la célula sin el filtro para confirmar esta hipótesis.
6. Conclusiones
Hemos visto que es importante realizar una buena extensión para que los elementos formes de la sangre estén en una monocapa y puedan observarse definidos en el microscopio. También es importante saber que tipo de tinción estamos realizando (para conocer el color con el que vamos a ver las células) y que la tinción se haga según el protocolo (para no colorear de más o de menos las células).
Por último, la calidad de la extracción y conservación de la sangre obtenida será crucial para que las células se observen de forma definida y se pueda hacer una valoración correcta de lo que estamos viendo en el microscopio. Con nuestra primera muestra (figuras 26-35) no hemos podido observar neutrófilos, que son unas de los leucocitos más numerosos en una muestra de sangre debido a la presencia de un coágulo de sangre. Sin embargo en la segunda muestra (figuras 36-41), obtenida del pulpejo del dedo corazón se han observado numerosos neutrófilos e incluso algunas plaquetas con mejor resolución, ya que la muestra estaba recién extraída.