Grupo 3. Laboratorio Clínico y Biomédico

Créditos: Azahara Gómez Romero, Carmen Jaime Muesa, María Luna Da Cruz, Andrea Muñíz Nieto, Claudia Sánchez Pato y Mariana Silva García.

Docentes: José Luis Rozas, Rocío Báez

1. Introducción.

El ELISA es  una técnica inmunológica ampliamente utilizada para detectar la presencia de anticuerpos específicos o antígenos en muestras biológicas. Los principios básicos de la técnica ELISA son los siguientes:

1. Inmovilización del antígeno o anticuerpo: En primer lugar, se fija el antígeno o anticuerpo de interés a una superficie sólida, como un pocillo de plástico o un tubo de ensayo. Esta inmovilización se puede realizar mediante la adsorción física, covalente o mediante el uso de agentes de unión específicos.

2. Bloqueo: Se añade una solución de bloqueo al pocillo para cubrir los sitios de unión no ocupados y prevenir la unión inespecífica de otras moléculas durante el ensayo.

3. Incubación con la muestra: Se añade la muestra biológica que se está analizando (suero, plasma, orina, etc.) al pocillo que contiene el antígeno o anticuerpo inmovilizado. Si hay anticuerpos específicos en la muestra, estos se unirán al antígeno inmovilizado.

4. Lavado: Se lava el pocillo para eliminar cualquier componente de la muestra que no se haya unido específicamente al antígeno o anticuerpo inmovilizado.

5. Detección: Se añade un anticuerpo secundario que está marcado con una enzima y que reconoce y se une a los anticuerpos primarios que están unidos al antígeno inmovilizado. Este anticuerpo secundario es específico para la especie de anticuerpo primario utilizada.

6. Segundo lavado: Se realiza otro lavado para eliminar el exceso de anticuerpo secundario no unido.

7. Reacción de la enzima: Se añade un sustrato para la enzima unida al anticuerpo secundario. La enzima convierte el sustrato en un producto detectable, generalmente un colorante o un compuesto fluorescente.

8. Medición de la señal: La cantidad de producto generado es proporcional a la cantidad de anticuerpos primarios presentes en la muestra original. La señal generada se mide utilizando un espectrofotómetro (para sustratos cromogénicos) o un fluorímetro (para sustratos fluorescentes).

9. Interpretación de resultados: Los resultados se interpretan comparando la señal medida en la muestra con la señal generada por controles positivos y negativos. La presencia o ausencia de la señal indica la presencia o ausencia del analito de interés en la muestra.

El ELISA se puede adaptar para detectar tanto anticuerpos como antígenos, lo que lo hace una herramienta versátil en la investigación y el diagnóstico médico.

2. Objetivos.

1. Realizar y dominar los conceptos experimentales del método ELISA.

2. Obtener un resultado que nos permita detectar IgG circulantes diferentes dirigidas a dos antígenos diferentes.

Otros objetivos secundarios son:

1. Practicar el correcto pipeteo.

2. Realizar diluciones seriadas.

3. Analizar datos obtenidos.

3. Materiales.

1. Agua destilada.

2. Vasos de vidrio o matraces.

3. Guantes desechables de laboratorio.

4. Gafas protectoras.

5. Tubos vacíos de microcentrífuga.

6. Micropipetas automáticas (5-50 μl) y (100-1000 μl) con sus respectivas puntas.

7. Placas de microtitulación.

8. Antígeno A1.

9. Antígeno B1.

10. Las muestras a analizar (Desc 1 y 2)

11.  Anticuerpo Primario A (AbA)

12. Anticuerpo Primario B (AbB)

13. Tampón de Lavado PBST 1x

14. Anticuerpo Secundario (2º Ab)

15. Substrato ABTS. 

16. Solución STOP.

4. Modus operandi.

Antes de empezar a realizar la práctica debemos preparar la placa de microtitulación, para ello, orientamos las placas de microtitulación de modo que los números 1-12 estén en la parte superior y las letras A-H estén a la izquierda. 

Después, cortamos cada placa a lo largo de las líneas continuas como se muestra en la figura.

En el próximo paso, con una nueva punta de pipeta, transferimos 50 μL del tubo B1 al pozo superior central de cada placa (columna 2, fila 1). Seguidamente, transferimos 50 μL del tubo B2 al pozo directamente debajo de la muestra anterior (Columna 2, fila 2), siempre con una nueva punta de pipeta. 

Continuamos agregando 50 μL de las muestras restantes de antígeno B en los pocillos correspondientes de la columna 2 en ambas placas.

Posteriormente, con una nueva punta de pipeta, transferimos 50 μL del tubo Desc1 a los tres pocillos superiores de la columna derecha de cada placa  (columna 3, filas 1-3).

También, transferimos 50 μL del tubo Desc2 a los siguientes tres pocillos de la columna derecha de cada placa (columna 3, filas 4-6).

Para concluir el proceso de diluciones de las proteínas estándar, incubamos ambas placas durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Procedemos a eliminar las muestras de las placas y realizar el lavado, para ello:

Invertimos las placas sobre el fregadero o una pila de toallas de papel para retirar las muestras. Sobre una toalla de papel nueva tapar suavemente las placas 4-5 veces más. 

Usando una pipeta Pasteur, agregamos el tampón de lavado para llenar cada pocillo, teniendo cuidado de no llenarlo en exceso, es decir, que no rebose

Es importante que evitar derramar el tampón en los pocillos vecinos, es decir, de un pocillo a otro.

De nuevo volcamos las placas sobre papel para eliminar el tampón, y nos aseguramos de que se ha eliminado por completo.

Repetimos el lavado de nuevo con tampón de lavado y pasamos a añadir los anticuerpos primarios y secundarios.

Rotulamos cada placa: una placa con "A" y la otra con "B".

ANTICUERPO PRIMARIO

Usando una nueva punta de micropipeta(20-200), pipetear 50 μL de Anticuerpo Primario A

(AbA) a cada pocillo de muestra en la placa A.

Para la placa B Usando una nueva punta de micropipeta, pipetear 50 μL de Anticuerpo Primario B

(AbB) a cada pocillo de muestra en la placa B.

Incubamos ambas placas durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Retiramos la solución sobre toallas de papel y procedemos a lavar los pocillos dos veces como hicimos anteriormente (pasos 20 al 23) con tampón de lavado.

ANTICUERPO SECUNDARIO

Repetimos los mismos pasos:

Usando una nueva punta de micropipeta, pipetear 50 μL del Anticuerpo Secundario (2°AB) a cada pocillo de muestra en ambas placas.

Incubamos el anticuerpo secundario durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Retiramos el anticuerpo volcando la placa sobre toallas de papel y procedemos a lavar 2 veces.

Por último añadiremos el sustrato que se unirá a los anticuerpos:

Usando una nueva punta de micropipeta, pipetear 50 μL de sustrato ABTS a cada pocillo de muestra en ambas placas.

Incubamos ambas placas de 2 a 5 minutos a temperatura ambiente, o hasta que el color ya no cambie en los pocillos con las concentraciones más altas de antígeno (Verde turquesa), aunque no se debe exceder los 10 minutos de incubación.

Una vez transcurrida la incubación agregamos 50 μL de solución STOP a cada pocillo de muestra en ambas placas. Homogeneizar.

Tomamos fotos de los resultados utilizando una cámara digital para tomar una foto. La colocación de las placas en una hoja de papel blanca o en una caja de luz blanca puede aumentar el contraste entre los pocillos.

6. Conclusiones.

Como conclusión final destacamos la correcta realización de la práctica ,ya que la mayoría de los objetivos tales como el correcto pipeteo ,la realización de diluciones seriadas y  la capacidad de analizar datos obtenidos se ha realizado de manera eficaz.

También podemos incluir el aprendizaje y dominio de  los conceptos experimentales del método ELISA.

Los resultados obtenidos no alcanzaron las expectativas previstas, principalmente debido a un error de pipeteo y mala calibración del material. Además, cabe resaltar que durante la fase de volteo de la placa para eliminar el excedente, se produjo una inesperada mezcla de los componentes contenidos en los pocillos, dando lugar a una contaminación de los mismos. Este incidente contribuyó de manera significativa a la desviación de los resultados esperados, subrayando la importancia de una ejecución precisa y cuidadosa en cada etapa del procedimiento experimental.