Protocolo de catalasa y oxidasa
Caracterización de microorganismos por pruebas bioquímicas: test de catalasa y oxidasa.
Grupo X
Rocío Báez, Cristina Pulido, Mercedes Pumariño, José Luis Rozas, Andrés A. Ventura.
Introducción
La identificación y determinación de especies bacterianas con interés clínico se ha basado, tradicionalmente, en pruebas de laboratorio consistentes en caracterización de su morfología, capacidad de degradar determinados compuestos y pruebas bioquímicas. A pesar del auge de las técnicas de PCR de amplificación de RNA16S que permiten determinar género, especie e incluso en ocasiones cepa o serotipo, las pruebas presuntivas como las bioquímicas siguen siendo de utilizad y continúan empleándose en el laboratorio. Es este protocolo detallamos cómo llevar a cabo una de estas pruebas, basada en la presencia de enzimas que degradan especies reactivas del oxígeno: la catalasa y la oxidasa.
Objetivos
El objetivo de la práctica es comprobar si el resultado de las pruebas bioquímicas de catalasa y oxidasa en tres especies diferentes de bacterias. Adicionalmente, veremos si esta prueba, por sí sola, es suficiente para hacer una determinación.
Materiales
Mechero de alcohol o bunsen con válvula de seguridad, asa de siembra de platino, portaobjetos de vidrio. Como reactivos se utilizarán peróxido de hidrógeno (H2O2) y reactivo de oxidasa en escobillones (Condalab).
Los microorganismos empleados, todos ellos, sembrados en medio NA son: Escherinchia coli, Staphylococcus aureus y Micrococcus varians (Figura 1).
Figura 1: materiales requeridos en la práctica
Modus Operandi
Prueba de la catalasa. En el centro de un portaobjetos de vidrio limpio se deposita un par de gotas de H2O2 al 30% (v/v). A continuación, después de esterilizar el asa y enfriarla, se toma una pequeña cantidad de material crecido de una de las placas (figura 2). Al ser un cultivo puro, no es necesario picar una colonia aislada; si fuera un cultivo mixto, habría que buscar una colonia aislada para hacer la prueba. A continuación se deposita el material sobre el H2O2 del portaobjetos y se observa la aparición de burbujas. La presencia de la enzima catalasa descompondrá el H2O2 con la consiguiente liberación de O2, lo que hará aparecer burbujas (figura 3).
Prueba de la oxidasa. Se extrae el escobillón impregnado de reactivo oxidasa que detecta la presencia de citocromo-c en las bacterias. Se impregna directamente el escobillón en la colonia o bien se recoge material de la colonia con el asa de siembra estéril y se deposita, haciendo un frotis, sobre el portaobjetos, y a continuación se pasa el escobillón por el frotis (figura 4). Se esperan 20 o 30 segundos para ver el viraje de color del reactivo. Si el color vira a rojo o rojo-granate, la bacteria es oxidasa + (posee citocromo-c). Si permanece incoloro o sólo vira ligeramente a rosa, se considera oxidasa – (figura 5).
Figura 2: Recogida del material de la placa una vez esterilizada el asa.
Figura 3: se pone en contacto el material del asa con el H2O2. Se observan las burbujas, al ser catalasa +.
Figura 4: se pasa el escobillón del reactivo oxidasa por el portaobjetos con el material.
Figura 5. No se observa ningún cambio de color en el reactivo, por lo que el microorganismo es oxidasa -
Resultados
Los resultados obtenidos en las pruebas fueron los siguientes:
Microorganismo Prueba
Catalasa Oxidasa
E. coli Positivo Negativo
S. aureus Positivo Negativo
M. varians Positivo Negativo
En el caso de E. coli, aunque la presencia de burbujas era en ocasiones difícil de advertir, se anotó como claramente positiva para la prueba de la catalasa.
Conclusiones
En todos los casos analizados los resultados se ajustaron a lo esperado según la taxonomía clásica para las especies problema. Se utilizaron dos cocos gram+, S. aureus y M. varians, pero sólo algunas especies del género Streptococcus son oxidasa negativo. La presencia de oxidasa es frecuente en bacterias aerobias estrictas como Pseudomonas aeruginosa, pero menos frecuente en anaerobias facultativas, como las tres especies analizadas aquí. Por el contrario, la presencia de catalasa es más extendida, especialmente en especies anaerobias facultativas, como queda bien reflejado. Como conclusión, podemos añadir que sólo las pruebas bioquímicas de catalasa/oxidasa no pueden, evidentemente, determinar ningún tipo de bacterias por sí solas, aunque junto con otras pruebas bioquímicas pueden ayudar a la determinación, puesto que son pruebas sencillas rápidas y sobre todo de lectura inmediata.
