INMUNOELECTROFORESIS

Grupo 1 LCB 2

Créditos: Belén Shi Asensio, Lucía Campos, Juana Galán, Laura Jiménez y Concepción Moreno.

Docente: José Luis Rozas

INTRODUCCIÓN

Inmunoelectroforesis: utilizada para separar e identificar proteínas en base a su comportamiento electroforético y a sus propiedades inmunológicas. Proteínas, tales como proteínas de suero de conejo, que son antígenos, cuando se inyectan en otro animal, como una cabra (el huésped), provocan la producción de anticuerpos en el huésped. La interacción entre el antígeno y su anticuerpo, que es también una proteína, es a la vez fuerte y altamente específica. Si se mezclan soluciones de antígeno y anticuerpo en diferentes proporciones, se encuentra que a una razón específica, conocida como punto de equivalencia, se maximiza la unión y se forma un precipitado de complejo antígeno-anticuerpo.

OBJETIVOS

• Conocer y realizar la técnica que combina una separación electroforética inicial de una mezcla de proteínas seguida por inmunodifusión con la formación de arcos de precipitación formada por la interacción antígeno-anticuerpo, llamada inmunoelectroforesis. La cual nos permite identificar una proteína de interés que se encuentre dentro una mezcla de proteínas

• Separar y caracterizar una mezcla de proteínas, así como analizar la especificidad de la interacción que se lleva a cabo entre el antígeno-anticuerpo.

• Separar las proteínas haciendo uso de sus propiedades iónicas

• Analizar la separación electroforética de antígenos.

• Reconocer el sistema antígeno-anticuerpo

• Identificar el número de proteínas en el suero

MATERIALES

• Cubetas de electroforesis

• Pajitas

• Asa de siembra

• Bandeja de formación de geles

• 2 Portaobjetos (unidos con cinta para formar la ranuras en el gel)

• Reactivos:

• Agar en polvo

• Tampón

• Antígeno desconocido

• Anticuerpo (IgG)

• Agua destilada

• Papel de filtro

• Micropipetas y puntas

MODUS OPERANDI

Para empezar a hacer la inmunoelectroforesis primero se debía realizar el gel de Agarosa y posteriormente la inmunoelectroforesis:

1. Formación del gel de Agar:

Añadir el contenido completo del frasco Agarosa a 100 ml de tampón de electroforesis diluido en un vaso.

1. Calentar la mezcla para disolver el polvo de agarosa. La solución final debe ser clara y transparente, sin partículas no disueltas.

2.  Calentar la mezcla durante 1 minuto. 

3. Agitar la mezcla hasta que toda la agarosa esté completamente disuelta.

4. Calentar la mezcla hasta que llegue al punto de ebullición con ayuda de un microondas.

5. Enfriar la agarosa. 

6. Mantenga la agarosa a 60°C hasta que realicen los geles. 

2. Antes de verter la solución de gel en la bandeja de formación de geles, construir un molde para los canales del gel utilizando dos portaobjetos de microscopio y la mitad inferior de una pequeña placa de petri.

1. Colocar un portaobjetos de microscopio en la base de la parte inferior de una placa de Petri

2. Colocar el segundo portaobjetos del microscopio en el lado opuesto de la placa de petri emparejado con el primer portaobjetos (el molde debe ser capaz de mantenerse en pie sin ayuda cuando se coloca sobre una superficie)

1. Verter una cantidad de gel de agarosa disuelto en las bandejas de formación de geles y poner inmediatamente el molde creado con antelación, para formar los canales en el gel

4. Preparar una cámara de humidificación de la siguiente forma:

1. Colocar en la parte inferior de un recipiente de plástico toallas de papel.

2. Agregar agua destilada, pero sin que se acumule un exceso de agua en el recipiente.

3. Cubrir con una tapa.

5. Una vez solidificado el agar en la bandeja, despegar el molde cuidadosamente para no dañar el gel. Se podrán observar dos canales.

6. Realizar los pocillos con ayuda de una pajita  (la distancia entre los canales y el borde de cada pocillo no debe ser superior a 0,5 cm)

7.- Transferir la bandeja que contiene el gel al aparato de electroforesis

8. Verter el tampón en la cubeta de electroforesis, (en ambos lados), pero con cuidado de que el tampón no cubra los geles. 

9. Cargar 20 μl de cada antígeno (A, B y C) en los pocillos. 

10. Colocar suavemente las mechas de papel de filtro sobre los extremos del gel (deben superponerse unos 3 a 4 mm) y dejar que se saturen con tampón de electroforesis. 

11. Encajar la tapa del aparato de electroforesis, insertar los cables en la fuente de alimentación con el cable negro en la entrada negra (negativa) y el cable rojo en la entrada roja (positiva).

12. Ajustar y encender la fuente de alimentación para la tensión requerida. Cuando la corriente fluye correctamente, deben formarse burbujas en los electrodos.

13. Una vez completada la electroforesis, desconectar la alimentación, desenchufar la fuente de alimentación, desconectar los cables y retirar la cubierta.

14. Retirar la bandeja de gel del aparato.

15. Añadir 50 μl de cada anticuerpo al canal correspondiente (E y D)

1. Colocar la bandeja en una cámara de humidificación/incubación cerrada que contenga toallas de papel humedecidas.

2. Permitir que la difusión tenga lugar durante un período de 24 a 48 horas, o hasta que se formen precipitados visibles en el gel.

RESULTADOS

Si se logró obtener una inmunoelectroforesis exitosa realizando el protocolo establecido, ya que el corrimiento a través del agar se logró correr anticuerpos del suero problema y el suero normal haciendo que aparezcan curvas de precipitación en estos.

Se pudieron identificar el número de proteínas en el suero entero a partir del número de arcos de precipitado.

CONCLUSIÓN

Tras realizar la inmunoelectroforesis y una vez obtenido el resultado del mismo pudimos confirmar que las líneas de precipitación fueron correctas y las esperadas.

Un inconveniente que nos surgió en el procedimiento de la inmunoelectroforesis fue la realización de los pocillos en el Agar solidificado con la utilización de pajitas, ya que fue complicado de retirar el agar de los pocillos con las pajitas y tu tuvimos que utilizar un asa de siembra para retirar el agar de los pocillos.

Sin contar con este inconveniente la práctica se realizó correctamente, dando los resultados esperados y óptimos siguiendo el protocolo establecido.

Enlace a protocolo (PDF)