T9 Primers

I. Conceptos de Primers

-Largo entre 18-30

-GC puede estar entre 35-65%, lo mejor es 45-50%

- No es bueno que tenga 4 seguidillas de un nucleótido, mucho menos de C o G

- La TM es la temperatura en la que el 50% de los oligos están perfectamente alineados o unidos al ADN

- Tm con parámetro de Santa Lucía genera una predicción mejor ajustada.

- Lo mejor es terminar el primer con un C o G

- Siempre hay que hacer el blast de los dos primers (se pueden poner los dos juntos)

- Si requieren de una referencial abajo está el Protocolo de Cold Spring Harbor

- Siempre para hacer el PCR se utiliza una temperatura entre 4 a 5 grados por debajo de la TM, lo que se conoce como Ta, abajo hay programas para calcularlo como el NEB.

II. Diseño Estándar de Primers

1. Primer 3

http://primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi

Cuidado con el cálculo de Tm, hay una Tm basado en parámetros termodinámicos y NN que son

●http://www.pnas.org/content/95/4/1460 (Santa Lucía, '98)

●http://www.pnas.org/content/83/11/3746 (Breslauer, '89)

–Artículo original: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3424584/

Breslauer es el parámetro por default, uno puede cambiarlo por Santa Lucía que es más preciso tanto en los parámetros de termodinámica, como en la corrección de la sal.

Herramienta alternativa, Genescript

https://www.genscript.com/tools/pcr-primers-designer

2. Biocompute

http://biocompute.bmi.ac.cn/MPprimer/

–Permite personalizar tamaños de productos de cada set de primers

–Revisión básica de dímeros de primers

–Personalizable (por parámetros)

–Visualización de amplicones en gel virtual

–Lleva algunos años sin actualizarse

–Artículo original: http://www.biomedcentral.com/content/pdf/1471-2105-11-143.pdf

3. Primique

http://cgi-www.daimi.au.dk/cgi-chili/primique/front.py

–Permite diseño de primers específicos para secuencias similares

–Artículo original:

– http://www.biomedcentral.com/1471-2105/8/369#B7

–Características:

●Poco (o nada) personalizable lo cual lo hace rígido

●Algoritmo de cálculo de Tm Novère (2001) con corrección de Santa Lucía ('98) y parámetros termodinámicos de Sugimoto ('96)

4. Exon Primer

https://ihg.gsf.de/ihg/ExonPrimer.html

Lo mejor es utilizar el browser genómico (https://genome.ucsc.edu) y dentro del gen ubicar la herramienta.

5. Primer Quest de IDT

http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index

6. Primers genómicos PCR-RT

http://mrprimerw2.com

III. Diseño Multiplex

1. Primer Multiplex con Prifi

http://cgi-www.daimi.au.dk/cgi-chili/PriFi/main

–Permite el diseño de un set de primers que amplifique múltiples secuencias

–Artículo original: http://nar.oxfordjournals.org/content/33/suppl_2/W516.full

–Gran capacidad de personalización de parámetros básicos

–Nula personalización de algoritmos o parámetros termodinámicos

–Requiere alineamiento previo

Fredslund J, Schauser L, Madsen LH, Sandal N, Stougaard J. (2005) PriFi: using a multiple alignment of related sequences to find primers for amplification of homologs. Nucleic Acids Res. 2005 Jul 1;33(Web Server issue):W516-20

2. GeneFisher

–Secuencias alineadas o no alineadas

–Primers degenerados

–Sitio: http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher2/submission.html

3. Primers for Clades

http://floresta.eead.csic.es/primers4clades/#0

IV. Probar los Primers

1. Oligoanalizer

https://www.idtdna.com/calc/analyzer

2. Primer Analyser de FastPCR

http://primerdigital.com/tools/PrimerAnalyser.html

3. Calcular TM de NEB

http://tmcalculator.neb.com/#!/

4. Análisis de Primers en Termofisher

Tm https://www.thermofisher.com/cr/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/tm-calculator.html

https://www.thermofisher.com/cr/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/multiple-primer-analyzer.html

5. PCR insilco online con FASTPCR

http://primerdigital.com/tools/pcr.html

Se puede descargar algún cromosoma y hacer un PCR insilico

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=human

6. Análisis de TM con Promega

http://www.promega.com/a/apps/biomath/?calc=tm

(La página aparte de permitir el cálculo de la Tm de los primers, mediante diferentes fórmulas, aclara en la sección inferior algunos detalles sobre los cálculos de estos parámetros)

7. DNA 2., herramienta de Primer Stats

https://www.dna20.com/resources/bioinformatics-tools

V. Probar los Primers en el Genoma

http://biocompute.bmi.ac.cn/CZlab/MFEprimer-2.0

Este sitio sirve para correr PCR.

Editar lo correspondiente a PPC a un 30%

TM de 30 a 80grados

Otro Sitio https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr

Genomas de Procariotes http://insilico.ehu.es/PCR/

VI. Notas

Qué es la corrección de Santa Lucía que aparece en el Primer 3?

http://bioinformatics.oxfordjournals.org/content/23/10/1289.full