ARCA CRIOGÊNICA

No presente projeto pretende-se estabelecer uma técnica de criopreservação de células somáticas que seja simples de ser feito em campo, deixando as complicações e refinamento tecnológico para os laboratórios de cultivo celular; neste sentido serão avaliados diferentes crioprotetores e diferentes tipos de material biológico como matriz para o banco criogênico. 

Os fibroblastos são células extremamente versáteis e relativamente fáceis de cultivar "in vitro", e por essa razão diversas instituições no mundo vem concentrando esforços na elaboração de bancos de fibroblastos com a expectativa de que esse material genético possa futuramente ser reintroduzido nas populações remanescentes de diferentes espécies (Machado et al., 2016).

Neste sentido, a reprogramação molecular de células somáticas surge como uma ferramenta promissora na conservação de espécies ameaçadas, pois permite a geração de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) a partir de células adultas diferenciadas (p.e. fibroblastos), com capacidade de se autorenovar indefinidamente e se diferenciar em diversos tipos celulares, inclusive em células do folheto germinativo (Ben-Nun et al. 2011). Por isso, será inicialmente acessada em tecido cutâneo, por meio de biópsias de pele, e em bulbo de penas em crescimento. Estes tecidos são reconhecidamente ricos em fibroblastos e de relativa facilidade de coleta.

Assim, serão propostos experimentos que basicamente avaliem fontes de células e crioprotetores. Posteriormente, investigaremos se a reprogramação celular usando genes de pluripotência humanos induz o desenvolvimento de iPSCs a partir de fibroblastos aviários. Nosso objetivo a longo prazo é estabelecer um protocolo de derivação de iPSCs em aves que possa ser empregado em espécies ameaçadas do CEP.

Responsáveis: Maurício Duarte Barbanti e Ricardo José Garcia Pereira.

Avaliação da matriz biológica como fonte de fibroblastos:

O número reduzido de indivíduos de espécies selvagens, algumas que inclusive podem estar ameaçadas, torna problemático o seu uso em pesquisas; assim, para estabelecer protocolos de cultura de tecidos, busca-se trabalhar com espécies mais comuns e abundantes, preferencialmente que sejam taxonomicamente próximas das espécies mais raras.

Neste projeto, estudos serão realizados com aves passeriformes domésticas, que podem servir como modelo biológico para obtenção dos tecidos em estudo. Serão adquiridos 10 espécimes fêmea de canário-belga (Serinus canaria), que serão mantidos em gaiolas coletivas, tendo como alimento ração comercial para pássaros e água em comedouros e bebedouros automáticos. Para obtenção de biópsia de pele, os animais serão anestesiados por meio de anestesia inalatória com o uso de Isoflurano, por ser o método mais seguro e rápido para anestesia de aves. Após limpeza da região com álcool 70%, será excisado um fragmento de 50 mm x 50 mm da região ventral, onde há pequena concentração de penas, sendo em seguida o ferimento fechado com o uso de cola cirúrgica. Pretende-se que todo o procedimento não leve mais que 5 minutos, desde a indução anestésica até o completo retorno da ave. Para obtenção das penas em crescimento, os animais terão as retrizes caudais arrancadas de uma só vez, sendo descartadas as penas adultas. Após isso, serão coletadas as penas em crescimento nas idades de 10, 15 e 20 dias pós-arrancamento. Com isso, espera-se avaliar o potencial de produção de fibroblastos nas diferentes idades da pena.

Como pretende-se que as coletas de células sejam feitas em campo, será testado um meio de cultivo que possa inibir a contaminação entre o local de coleta e o laboratório de campo, onde as amostras serão congeladas. Inicialmente será testado um meio que tem sido utilizado para coleta com mamíferos, alterando os níveis de antibióticos no sentido de que protejam contra as contaminações e não influenciem negativamente no crescimento celular. Será avaliado um tempo de estocagem em refrigeração (4° C) de 12 horas, que seria o suficiente para o tempo de deslocamento entre o sitio de coleta e o laboratório de campo.

Responsável: Maurício Duarte Barbanti.​

     Avaliação do crioprotetor e congelamento:

     Serão avaliados três tipos e combinações de crioprotetores nos meios de congelação. Tanto o fragmento de pele como os bulbos das penas serão depositados em tubos criogênicos com meios crioprotetores, onde permanecerá por 3 horas em refrigeração (4o C). Após isso permanecerão por 30 min no vapor do nitrogênio líquido, que será obtido colocando o nitrogênio líquido em um isopor e as amostras permanecendo 2 cm acima do nível do nitrogênio líquido. Após isso, os criotubos com as amostras serão mergulhados no nitrogênio liquido, onde permanecerão até seu uso para replicação.

     Responsável: Maurício Duarte Barbanti.

     Descongelação e cultivo de fibroblastos:

     Uma vez no laboratório de citogenética do NUPECCE (Núcleo de Pesquisa e Conservação de Cervídeos), UNESP, Jaboticabal SP, as amostras de pele ou bulbo de pena serão descongeladas em banho-maria a 37o C e colocadas em placas de Petri, contendo tampão fosfato, sendo então divididas em fragmentos finos. Estes serão transferidos para os frascos de cultivo com 1 ml de meio de cultura e levados a estufa a 37°C e 5% de CO2. Após a aderência das células no frasco, o meio será trocado. Os cultivos serão supervisionados a intervalos de 24 horas, e o meio será trocado a cada dois dias. Para comparação entre as matrizes utilizadas (pele e penas) e os diferentes crioprotetores será considerado o período em que as células chegaram à confluência. A partir dos tempos de confluência médios para cada um dos materiais e tratamentos será avaliada a significância por um teste t com p<0,05.

     Responsável: Maurício Duarte Barbanti.

Geração das células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs):

Os fibroblastos serão transduzidos com partículas lentivirais contendo os fatores de transcrição (Lu et al., 2012). As transduções serão realizadas na presença de reagente específico e as células transduzidas serão então cultivadas sobre uma camada alimentadora para expansão. As células-tronco induzidas serão coletadas com base em sua morfologia, e novamente expandidas sem a utilização de camadas alimentadoras. Todas as linhas derivadas serão testadas para pluripotência pela determinação da expressão protéica e serão avaliadas quanto a sua habilidade em se diferenciarem nos três folhetos germinativos (ecto-, meso- e endoderma), pela formação de corpo embrióide e testadas para a expressão gênica indicativa de todas as três linhagens.

Responsável: Maurício Duarte Barbanti.