1. Análise do conteúdo das vesículas extracelulares presentes no plasma de pacientes com Carcinomas Espinocelulares de Cabeça e Pescoço para identificação de marcadores moleculares de resistência à terapia: O câncer é responsável por 13% das mortes no mundo, sendo a segunda maior causa de mortalidade, principalmente em países emergentes. Dentre os diferentes tipos de neoplasias, o carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço (CECP) é uma doença com alta incidência e mortalidade. Entre as principais causas para esta alta mortalidade destacam-se a detecção tardia, a falha na primeira modalidade de tratamento e o frequente desenvolvimento de recidivas loco-regionais, fatores estes que contribuem para uma sobrevida global em 5 anos de apenas 50%. A escolha das estratégias terapêuticas adotadas no tratamento dos CECP baseia-se, fundamentalmente, na localização do tumor e no sistema de estadiamento TNM. Entretanto, em muitos casos, tumores com mesmo estadiamento clínico e localização, tratados pelo mesmo método, apresentam padrões de recorrência e riscos de óbito diferentes. Portanto, existe uma necessidade premente por novas ferramentas que possam ser úteis para auxiliar na determinação do prognóstico, na definição da abordagem terapêutica a ser empregada e no desenvolvimento de novas e eficazes formas de tratamento. A radioterapia (RT) é bastante usada no tratamento dos casos iniciais de CECP, mas, em geral, 20-30% dos pacientes não respondem à RT. Atualmente, não há indicadores capazes de prever quais tumores são propensos a responder à RT e quais são aqueles que serão resistentes e persistirão. Portanto, é necessário encontrar novos marcadores para discriminar, de antemão, quais os pacientes que poderão se beneficiar do tratamento com RT. Sabe-se que as células de mamíferos, incluindo as células cancerígenas secretam vesículas extracelulares (EV) que carregam proteínas, transcritos gênicos e microRNAs. Estas EVs são secretadas por muitos tipos celulares e estão presentes em fluidos corpóreos (plasma, saliva, urina, etc.). A hipótese levantada no subprojeto 1 prevê que EVs presentes no plasma de pacientes com CECP podem conter moléculas específicos que podem ser úteis para prever a resposta à RT. De tal forma, ao se comparar o conteúdo das EVs extraídas de plasma de pacientes com CECP se poderá distinguir os tumores respondedores e não-respondedores à RT.

1. Efeitos do tratamento tópico da melatonina associada à membrana osteogênica e à proteína rhBMP-2 sobre o remodelamento ósseo: Este estudo busca avaliar os efeitos sinérgicos do tratamento da melatonina associada a uma membrana osteogênica e à BMP-2 sobre a recuperação de uma lesão óssea. Este projeto é inovador, pois além de tratar a questão apresentada, da visão morfológica, evidenciando os reais efeitos de cada tipo de tratamento e sua possível eficácia; incluiremos uma nova visão do entendimento do tecido de forma geral com análises de biologia molecular, o que nos trará um maior esclarecimento de como cada tipo de tratamento estará apresentando os resultados morfológicos observados. Sendo assim serão avaliados os efeitos da administração da melatonina tópica em diferentes concentrações no reparo ósseo em defeitos ósseos cirúrgicos através da técnica, associada ou não à rhBMP-2 por meio das seguintes técnicas: a) Avaliação qualitativa por análise histopatológica por meio de microscópio de luz. b) Avaliação quantitativa por meio da técnica de estereologia. c) Avaliação de fatores angiogênicos, osteogênicos e osteoclastogênicos por meio da técnica de imunoistoquímica. d) Avaliação da expressão gênica de citocinas (IL-1², IL-6, IL-10 e TNF-±), marcadores da osteoclastogênese (RANK, RANKL e OPG) e MMPs (MMP-1, MMP-8 e MMP-13)..

2. Efeitos tóxicos da microcistina-LR na musculatura branca de peixes da espécie Astyanax altipanae.

1. Estudo da capacidade de fármacos e novas moléculas em inibir a resposta pró-inflamatória pulmonar mediada por NSP3 de SARS-CoV-2 através da modulação da via de STAT3: A recente epidemia de COVID-19 é um dos maiores desafios para a saúde pública neste século. A sua facilidade de transmissão e sua progressão para quadros clínicos, que em muitos casos necessitam de internação hospitalar, exigem redirecionamento de esforços para combater esse vírus. O SARS-CoV-2 é um coronavírus, com muita similaridade ao coronavírus encontrado em morcegos e que deve ter se transmitido para hospedeiros humanos na província de Wuhan, na China. Pessoas com comorbidades, principalmente aquelas com sistema imune suprimido, diabéticos e idosos sofrem as consequências mais graves dessa infecção. Quando infecta o trato respiratório inferior pode interferir com a função pulmonar, causar exacerbação da atividade imunológica, levando à tempestade de citocinas e resposta inflamatória aumentada, pode ainda ocorrer fibrose pulmonar e eventualmente falência pulmonar e de outros órgãos. Novos ou antigos fármacos devem ser reposicionados com urgência para avaliar se apresentam atividade contra esse novo coronavírus. Os fármacos, Nifuroxazida e Metformina são usados há décadas e recentemente têm sido reposicionadas para outras doenças, como por exemplo, câncer, isso porque, são potentes agentes inibidores de STAT3, que se apresenta constitutivamente ativada em diferentes formas de câncer. O SARS-CoV, que causou o surto de coronavírus entre 2002-2003, expressa a proteína, NSP3, que possui o domínio PLpro, que leva à ativação de STAT3, que por sua vez pode acarretar na ativação de TGF-β1, e pode promover a fibrose pulmonar, além de participar da ativação exacerbada do sistema imune. Pretendemos neste projeto avaliar a capacidade desses fármacos em inibir STAT3 em diferentes linhagens celulares que super 2 expressem a proteína NSP3 e avaliar a expressão de genes relacionados com a fibrose pulmonar, como colágeno do tipo I, além da ativação de TGF- β 1 e citocinas pró-inflamatórias. Visando avançar no conhecimento da ação da metformina na infecção viral, iremos ainda avaliar prontuários de pacientes com COVID-19 para verificar se os mesmos ao fazerem uso de metformina têm prognóstico mais favorável, comparados com aqueles que não a receberam durante ou previamente à internação.

2. Desenvolvimento de sistema adenoviral de alta capacidade expressando genes com atividade antitumoral: A terapia gênica através de vetores virais possui grande potencial, já sendo usado em protocolos clínicos em humanos. Os vetores adenovirais de terceira geração (alta capacidade, gutless, ou helper-dependentes-HD) são mais seguros que os vetores de primeira geração e possuem alta capacidade de inserção genica, porém a principal limitação para a sua aplicação em larga escala diz respeito à obtenção de partículas virais livres da contaminação pelo vírus helper. Os adenovírus de sorotipos filogeneticamente próximos possuem capacidade de empacotamento cruzado, porém vírus mais filogeneticamente distantes não. Assim desenvolveremos um sistema adenoviral de alta capacidade, em que o vetor gutless e o vetor helper, sejam filogeneticamente distantes e, portanto, o vetor helper seja incapaz de ser empacotado e presente como contaminante na preparação do Ad-HD. Eliminar a contaminação pelo vírus helper tem um grande potencial para aumentar o emprego dos vetores Adenovirais de alta capacidade. Pretendemos empregar vetores adenovirais como veículos para a transferência de genes com atividade antitumoral. Serão empregadas estratégias de expressão de gene suicida aliada a gene imunomudulatório com expressão condicional e de produção de toxinas bacterianas. Os genes da timidina quinase do vírus da Herpes Simplex (HSVtk) e Interleucina-12 (IL-12) são muito bem descritos, sendo um ótimo modelo para iniciar estes estudos, pretendemos clonar os genes HSVtk e IL-12 otimizado em vetor adenoviral com promotor responsivo a calcitonina e avaliar a sua atividade sobre células de carcinoma medular de tireóide. Outro gene que será avaliado é o gene Azurin, que possui atividade seletiva somente sobre células tumorais. Dessa forma iremos avaliar estes vetores quanto à capacidade de induzir morte das células tumorais in vitro e in vivo. Atualmente estamos investigando uma larga biblioteca bacteriana quanto à capacidade de produzir produtos capazes de inibir a viabilidade de células de câncer de próstata, havendo assim a perspectiva de identificação de novos genes bacterianos com atividade antitumoral.

3. Avaliação da atividade antineoplásica in vivo e in vitro de compostos bioativos naturais e sintéticos e desenvolvimento de um modelo de cultura de organoides de tumores para testes de drogas: O câncer é a segunda principal causa de mortalidade no mundo. Nos últimos anos houve um aumento do número de mortes por câncer de tireoide agressivo diferenciado e indiferenciado, não houve melhora na sobrevida dos pacientes com câncer de próstata avançado e metastático e a taxa de sobrevida dos pacientes com câncer de cabeça e pescoço pouco tem mudado no últimos 20 anos. Portanto, a pesquisa de novos compostos com atividade antineoplásica ou que melhorem a ação das terapias já existentes é crucial. Aproximadamente 60% dos medicamentos aprovados pelo FDA para o tratamento do câncer são compostos bioativos obtidos de produtos naturais ou sintéticos que se baseiam ou imitam esses produtos, como os alcaloides de vinca e o paclitaxel. Um dos maiores desafios da pesquisa de drogas é traduzir os bons resultados obtidos em culturas celulares em laboratório para a clínica (from bench to bed), pois esses modelos representam apenas uma parte das características do tumor do paciente. Na busca de novos modelos in vitro, mais sofisticados para testes de drogas, vem sendo desenvolvidas culturas de células tridimensionais (3D) de esferoides, a partir de linhagens celulares, ou de organoides, a partir de amostras tumorais de pacientes. Assim, o primeiro objetivo deste projeto é avaliar a atividade antineoplásica de uma série do compostos bioativos naturais e sintéticos in vitro e in vivo e caracterizar os mecanismos de ação e as vias de sinalização envolvidas. Para tanto, os compostos serão testados em culturas de esferoides (3D) e em monocamadas (2D) de uma série de linhagens celulares de câncer de tireoide, próstata e cabeça e pescoço, que inclui as formas mais agressivas. Os esferoides serão formados utilizando as técnicas de gota invertida (?hanging drop?) ou de levitação magnética. Será determinada a concentração inibitória de 50% (IC50) em cada modelo e a citotoxicidade em células não tumorais. Também serão avaliados os efeitos dos compostos na viabilidade, morte celular, ciclo celular, migração e invasão. A apoptose será caracterizada através da ativação das caspases e será verificada a indução de morte imunogênica, a geração de espécies reativas de oxigênio, a modulação da transição epitélio-mesenquima (entre outras vias de sinalização) e a indução de modificações epigenéticas. Nos modelos de tireoide, será verificada a capacidade dos compostos de rediferenciar as células, através da reexpressão do simportador de sódio/iodo (NIS) e de outros genes específicos da tireoide e a capacidade de aumentar a captação de iodeto. A atividade in vivo daqueles compostos com maior atividade antineoplásica in vitro será determinada através da avaliação do tamanho do xenotransplante tumoral em camundongos imunosuprimidos antes e após os tratamentos. O segundo objetivo deste projeto é desenvolver e caracterizar um modelo in vitro de organoides de câncer para testes de drogas. Os organoides serão desenvolvidos utilizando os mesmos métodos dos esferoides a partir de amostras tumorais e não tumorais de tireoide coletadas durante tireoidectomia. Os organoides serão caracterizados através da expressão de genes específicos da tireoide e por análises de imagens, para finalmente comparar os resultados do tratamento de alguns dos compostos nos diferentes modelos. Desta maneira esperamos contribuir com a identificação e caracterização de novos compostos com potencial terapêutico para os três modelos de câncer incluídos nesta proposta, com um modelo de cultura de esferoides 3D abrangente e adequado para testes de drogas e com um novo modelo de organoide de câncer.

4. Identificação de aletrações genéticas e cromossômicas no exoma completo de pacientes com Hipotireoidismo Congênito por disgenesia tireoidana.

5. Investigação das bases moleculiares do câncer não medular familiar de tireoide.

6. Genética e epigenética do Hipotireodismo Congênito

7. Metilação e cancer de tireóide

8. Estudo funcional da Tireoperoxidase (TPO) portadora de mutações identificadas em pacientes com Hipotireoidismo Congênito com defeito parcial de incorporação de iodeto.

1. O papel da autofagia no crescimento a alta temperatura (37°C) e virulência em Cryptococcus neorformans: As infecções fúngicas são muitas vezes difíceis de tratar, em virtude das semelhanças entre as células fúngicas e animais por esta razão muitos dos compostos antifúngicos são tóxicos aos hospedeiros. Cryptococcus neoformans é um fungo patogênico oportunista dos seres humanos que causa a doença que se não tratada pode ser fatal, principalmente em pacientes imunocomprometidos. Em decorrência de opções limitadas de antifúngicos para o tratamento desta micose, muitos investigadores têm explorado novos alvos para drogas que visam fatores de virulência, tais como a capacidade de crescer à temperatura fisiológica dos mamíferos (37°C). Com objetivo de aumentar este conhecimento, foi estabelecida uma biblioteca de mutantes insercionais mediada por Agrobacterium tumefaciens (AMT, Agrobacterium mediated transformation). Esta biblioteca foi pesquisada com o intuito de se identificar mutantes incapazes de crescer em temperatura fisiológica (Gontijo et al., 2014). Entre os vários mutantes termossensíveis a 37°C, caracterizamos um onde a interrupção ocorreu no gene APE4, o qual codifica uma aspartil aminopeptidase que em Saccharomyces cerevisiae está envolvido nos processos Cvt (cytoplasm to vacuole targeting) e autofagia. O mutante ape4 de Cryptococcus neoformans não é capaz de crescer a 37°C e é avirulento em modelo animal (murino). Em C. neoformans os processos Cvt e autofagia foram pouco estudados e a relação entre termotolerância e autofagia ainda não havia sido estabelecida. Dentre os cinco genes que codificam proteínas envolvidas nesses processos em S. cerevisiae (APE1, APE4, AMS1. ATG19 e ATG8) apenas três foram prontamente identificados no genoma de C. neoformans (APE4, AMS1 e ATG8) usando as ferramentas clássicas de bioinformática. Isso deixa claro que existem diferenças fundamentais entre C. neoformans e S. cerevisiae no que tange estes dois processos biológicos. Portanto, o objetivo geral deste projeto é esclarecer as bases moleculares do mecanismo de Cvt e autofagia em C. neoformans. Para atingir tal objetivo este projeto contempla: 1) a deleção dos genes AMS1 e ATG8 do genoma desta levedura e análise dos mutantes, visando efetivar o elo entre Cvt, autofagia, termotolerância e virulência; 2) verificar a localização subcelular destas proteínas de fusão ao GFP (green fluorescent protein) levando em conta a temperatura de crescimento e as diversas condições nutricionais, como a privação de nutrientes essenciais, e diferentes fontes de carbono e nitrogênio (preferenciais e não preferenciais); 3) levando em consideração que algumas proteínas importantes do processo Cvt e autofagia de S. cerevisiae não foram identificadas no genoma de C. neoformans, este projeto buscará identificar por meio da metodologia de duplo híbrido os parceiros moleculares das proteínas APE4 e AMS1, os quais devem colocá-las corretamente no local onde ocorre a formação das vesículas de degradação mediadas por ATG8. No sentido amplo este projeto pretende elucidar as bases moleculares da autofagia em C. neoformans, uma vez que o mesmo parece ser bastante diferente de S. cerevisiae, bem como associar estes elementos à virulência e patogênese. Espera-se que estes conhecimentos sejam úteis na proposta de novas terapias antifúngicas.

2. Avaliação dos genes da via de biossíntese do triptofano no patógeno oportunista Cryptococcus neoformans quanto a sua aplicabilidade como alvo de drogas antifúngicas: As micoses causadas por fungos oportunistas, como a Candida albicans, Aspergillus fumigatus e o Cryptococcus neoformans são cada vez mais ameaçadoras para a saúde pública considerando o grande aumento na população imunocomprometida mundial, principalmente àqueles relacionados a casos de transplantes de órgãos, quimioterapia anti-tumoral e imunossupressão causada por HIV. Especificamente em pacientes com AIDS o tratamento é prolongado e implica na administração de antifúngicos para o resto da vida do paciente, o que leva ao surgimento de cepas resistentes com alta freqüência. Além disso, os antifúngicos apresentam baixa toxicidade seletiva, uma vez que a célula fúngica é mais parecida com a célula animal do que a célula procariótica, diminuindo assim a disponibilidade de alvos úteis para o desenvolvimento de novas drogas antifúngicas. Por esta razão, faz-se necessário um esforço constante da comunidade científica no sentido de ampliar a prospecção e validação de alvos, bem como a identificação de inibidores mais específicos, o que pode refletir em terapias mais diligentes. Anteriormente, Pascon et al. (2004) demonstraram que a via de biossíntese da metionina é um alvo significante para o desenvolvimento de novas drogas antifúngicas, uma vez que mutações em genes desta via afetam diversos fatores de virulência. Os aminoácidos aromáticos são essenciais ao crescimento de qualquer organismo, mas são sintetizados de novo somente pelos microrganismos, plantas, e parasitas apicomplexos, sendo a sua síntese ausente em animais superiores. O triptofano, ao contrário da tirosina e da fenilalanina, possue somente uma rota de síntese. Esta via biossintética nunca foi estudada em C. neoformans. O objetivo deste trabalho é validar o uso dos quatro genes envolvidos na síntese do triptofano como alvo de novos antifúngicos. Serão avaliados vários aspectos da biologia desta levedura nas linhagens mutantes e nas reconstituídas, dentre os quais, a interação patógeno-hospedeiro.

1. Cryptococcus neoforman e as relações entre virulência, metabolismo do enxofre, estresse osmótico e oxidativo: O grupo de pesquisa do Laboratório de Interações Microbianas da UNIFESP (LIMic) possui uma linha de pesquisa que estuda os mecanismos genéticos que controlam a resposta ao estresse nutricional em fungos, a qual é essencial para patogênese. Além disso, faz parte desta linha de pesquisa, prospectar novos inibidores que tenham potencial antifúngico. O tratamento contra patógenos eucariotos é difícil, pois há poucas opções de fármacos e baixa toxicidade seletiva dos mesmos. Portanto, este estudo busca novas estratégias terapêuticas, as quais dependem da identificação de novos alvos moleculares que podem ser úteis para o desenvolvimento de fármacos contra micoses profundas. Os pesquisadores deste grupo usam a levedura oportunista Cryptococcus neoformans como modelo de estudo. Alem disso, este patógeno tem grande importância médica porque causa meningite fúngica em indivíduos imunocomprometidos, sendo a principal causa de fatalidades em pacientes com AIDS, juntamente com a tuberculose. Nos últimos sete anos, nós demonstramos que a biossíntese e a captação de aminoácidos são processos essenciais para virulência em C. neoformans e são muito diferentes entre os fungos e os animais. Ainda, por meio do uso de técnicas de engenharia genética, biologia celular, proteômica e transcriptômica, nossos dados mostraram que (i) a captação de aminoácidos por permeases é regulada pela via de sinalização de Ras1; (ii) a captação do enxofre e a biossíntese de aminoácidos sulfurosos é regulada pelo fator de transcrição Cys3 em conjunto com o complexo Calcineurina, revelando uma relação inédita na literatura entre estes elementos genéticos, os quais são essenciais para virulência e patogenicidade. Ainda, os estudos anteriores mostraram que (iii) existe um elo entre o metabolismo do enxofre, o balanço osmótico garantido pela biossíntese do glicerol e o estresse oxidativo. Este último achado abriu uma nova linha investigativa que precisa ser desenvolvida, pois coloca o metabolismo do enxofre no centro de processos relevantes para a virulência, como a resistência aos estresses encontrados no hospedeiro. Portanto os objetivos deste trabalho são (1) aprofundar os estudos sobre as relações regulatórias previamente observadas entre o fator de transcrição Cys3 e a ATP sulforilase Met3, sendo esta última de estrutura muito distinta entre fungos, as plantas e animais; (2) expandir o entendimento do mecanismo de regulação da calcineurina sobre a via de assimilação de enxofre e o estresse osmótico; (3) desenvolver os estudos sobre o papel de Gpp2 na captação do enxofre e na biossíntese dos aminoácidos sulfurosos, bem como na via de biossíntese de glutationa e na resposta ao estresse oxidativo; (4) faz parte deste trabalho testar a atividade antifúngica de análogos da metionina e derivados do ácido cumárico sobre o crescimento e a melanização, respectivamente. Espera-se que este estudo reflita em novos conhecimentos sobre a resposta ao estresse nutricional e em novos alvos para o tratamento da criptococose e outras doenças fúngicas.

2. Caracterização genética dos elementos regulatórios que controlam a biossíntese e a assimilação de aminoácidos e o seu papel na virulência de Cryptococcus neoformans.

3. Caracterização genética dos elementos regulatórios que controlam a biossíntese e a assimilação de aminoácidos e o seu papel na virulência de Cryptococcus neoformans.

1. Estudo-Piloto para a Implantação de uma Rede Brasileira de Vigilância de Resistência Antimicrobiana em Saúde Única.

2. Avaliação do Impacto de Novas Proteínas no Desenvolvimento de Resistência às Polimixinas em Isolados Clínicos de Acinetobacter baumannii.