Extracción de ADN
Extracción mediante el kit comercial INSTAGENE
Cada mesa dispone de una levadura (práctica VI) y una bacteria problema (práctica VIII). Las mesas pares utilizarán la levadura y las impares la bacteria correspondiente. En ambos casos, se selecciona una colonia del microorganismo desarrollado en un medio sólido y se resuspende en 1 mL de suero fisiológico estéril. Se agita fuertemente hasta conseguir una suspensión homogénea y se centrifugan a 3000‐5000 rpm durante 3‐5 minutos. Se retira el suero sobrenadante y nos quedamos con el precipitado de células. Cerrar y rotular adecuadamente el tubo.
Extracción de ADN :
1. Al precipitado que tenemos despues de centrifugar le añadimos 200 μL de solución de lisis (agitar previamente).
2. Mezclar y poner a 56ºC durante 15 min.
3. Pasado este tiempo agitar en el vórtex 10‐15 segundos por tubo
4. Poner en un baño a 100ºC durante 8 minutos.
5. Agitar de nuevo en vórtex 10‐15 segundos por tubo
6. Centrifugar 1 minuto a máxima velocidad.
7. Usar el sobrenadante (es donde se encuentra el DNA) para la realización de la PCR.
Extracción mediante ciclos de temperatura
A partir de la placa de cultivo puro se cogerá una colonia bacteriana aislada. Tras marcarla con indeleble se procede a picar la colonia con el asa de siembra y pasar a un eppendorf con 100 μl de TE.
Incubar en baño a 95ºC durante 5 minutos
Incubar en frío durante 1 minuto
Vortex
Incubar en frío durante 2-4 minutos
Vortex
Repetir todo el ciclo 2 veces más
Centrifugar a 9500 rpm durante 5 minutos
Recuperar 20 μl de la parte superior del sobrenadante y pasarlo a un nuevo eppendorf correctamente rotulado.