Filogenómica Anvio

Preparación de archivos

Es importante que los archivos fasta cumplan las siguientes características:

• El nombre del archivo solo debe llevar caracteres alfanuméricos
• De ser necesario, solo pueden llevar guion bajo en el nombre, no puntos ni guión medio.
• La terminación del archivo debe ser .fa
• Los nombre NO deben empezar con un número
• Los nombres de las secuencias deben ser cortos, sin espacios y solo con caracteres alfanuméricos y cuando mucho guión bajo.

Set de datos

Si quieres seguir los pasos aquí descritos con el mismo set de datos, cepas de E. coli, puedes descargar el set de datos de aquí. Los genomas del set son los siguientes:

• DH10B (= K12), 1 cromosoma. CP0000948
• 0157:H7 str. TW14359, 1 cromosoma 1 plásmido. CP001368
• DH1, 1 cromosoma. CP001637

Una vez descargados de aquí, los puedes descomprimir en la carpeta en la que se vaya a trabajar y en donde solo estén ellos:

$ tar xzf ecoli.tar.gz

Análisis

Activar anvio, si tenemos una versión instalada en nuestra cuenta:

$ source ~/virtual-envs/anvio5/bin/activate

Si usaremos la cuenta común en CONDA (recomendada):

$ conda activate anvio5

NOTA. Sólo usar una de las dos opciones.

Los comandos para el nuevo anvio 6 (aún no probado) se encuentran aquí.

Generar una base de datos para cada genoma, como tenemos varios genomas a procesar podemos hacer un for loop. Este script checa los archivos fasta para ver si cumplen las características antes señaladas y si no los reformatea (anvi-script-reformat-fasta), crea la base de datos (anvi-gen-contigs-database) y busca genes housekeeping (anvi-run-hmms).

Este proceso puede durar horas y por lo tanto no sería raro que la terminal se desconectara antes de terminar, para evitar esto hay varias opciones, una buena es usar el comando de linux screen.

Primero hay que crear una nueva "sesión" con screen que la llamaremos contigs2dbs, pero puede ser cualquier nombre útil:

$ screen -S contigs2dbs

Una vez que se activa esta sesión podemos ya ejecutar el comando anterior pero teniendo cuidado de activar anvio primero:

$ conda activate anvio5

$ for f in *.fa; do anvi-script-FASTA-to-contigs-db $f; done

Una vez corriendo podemos "desconectarnos" de la sesión y volver a la sesión de terminal anterior presionando al mismo tiempo las teclas Ctrl A D:

$ Ctrl A D

Para volverse a conectar a la sesión y ver como va el análisis:

$ screen -r contigs2dbs

Si solo hemos hecho una sesión entonces no hace falta poner el nombre de la sesión, solo screen -r. Más información de screen aquí.

Al terminar el paso anterior, que puede durar horas, habrá que generar un listado de los genomas para usar con los siguientes pasos de anvio.

Generar un archivo con los nombres de los genomas y la ruta a los archivos de la base de datos a la que pertenecen

$ ls -1 *.fa > names.tmp

$ ls -1 *.db > dbs.tmp

$ paste names.tmp dbs.tmp > genome.list

$ rm *.tmp

$ sed -i 's/.fa//g' genome.list

$ sed -i '1i name\tcontigs_db_path' genome.list

El archivo de salida, genome.list, debe tener la siguiente estructura:

name          contigs_db_path

CP001368_0157 CP001368_0157.db

DH10B         DH10B.db

DH1           DH1.db

La primer columna (name) podemos cambiarla al nombre que deseemos, pero la segunda columna no. Para los nombres de la primer columna NO usar nombres que empiecen con número! La separación entre columnas es con tabuladores.

Opcionalmente, podemos añadirle funciones a los genes de cada genoma, para lo cual usamos la base de datos COGS de NCBI.

$ for f in *.db; do anvi-run-ncbi-cogs -c $f --num-threads 8; done

Obtener los Single Copy Genes (SCG) para el análisis filogenético, checar si anvio está activado aún, si no, volver a activarlo.

$ anvi-get-sequences-for-hmm-hits --external-genomes genome.list -o concatenated-proteins.fa --hmm-source Campbell_et_al --return-best-hit --get-aa-sequences --concatenate

Crear un árbol filogenético con los SCG

$ anvi-gen-phylogenomic-tree -f concatenated-proteins.fa -o phylogenomic-tree.txt

Podemos también obtener el pangenoma:

$ anvi-gen-genomes-storage -e genome.list -o PANGENOME-GENOMES.db

$ anvi-pan-genome -g PANGENOME-GENOMES.db -n PANGENOME -T 8

Si se colaron archivos con nombre no aptos, ver arriba, aquí es donde se botará el proceso con un error. El segundo comando puede tardar bastante en completarse.

Hacer un análisis de Average Nucleotide Identitity (ANI)

$ anvi-compute-ani -e genome.list -o ANI -p PANGENOME/PANGENOME-PAN.db -T 8

Por último podemos agregar información para que también aparezca en el pangenoma, esta información debe ir en una un archivo de texto separado por tabuladores (NO usar Word), por ejemplo:

sample  year   country  source

DH1     1983   USA      Human

DH10B   1960   USA      Unknown

Ec0157  2006   USA      Clinical

La primer línea debe empezar con sample y ésta columna debe tener los nombre idénticos a los archivos fasta usados al principio pero sin la extensión. Las siguientes columnas pueden ser los datos que se quiera, pero tratando de no mezclar palabras con números. Podemos nombrar a esta tabla data_for_layers.tsv por ejemplo.

El comando para incorporarla a la base de datos genera de anvio sería:

$ anvi-import-misc-data data_for_layers.tsv -p PANGENOME/PANGENOME-PAN.db --target-data-table layers