Binning

Es posible recrear genomas completos o casi completos a partir de varias muestras secuenciando todo el metagenoma (shotgun) mediante un método conocido como binning (cita) para obtener "especies metagenómicas" o "Metagenome Assembled Genomes" (MAG).

Básicamente es necesario realizar un ensambles de cada uno de los metagenomas (se recomiendan al menos 5) y clasificar cada uno de los contigs encontrados a un cajón (binning), a partir de cada contig proveniente de diferente metagenoma, reconstruir los genomas encontrados (ver figura).

Claro, es necesario primero limpiar las secuencias.

Procedimiento

1. Ensamble con megahit.

A partir de secuencias pair-end, esta opción da mejores resultados:

$ megahit -1 R1.fastq -2 R2.fastq -o megahit -t 8

Si se tienen varios metagenomas en fastq, entonces se puede ejecutar así, nótese que están separados por comas los archivos fastq:

$ megahit -1 Sample.R1.fasta,Sample.R2.fastq -2  Sample.R2.fasta,Sample.R2.fastq -o megahit -t 8

Ensamble a partir de varios metagenomas ya en formato multifasta:

$ megahit -r sample1.fasta,sample2.fasta,sample3.fasta -m 0.2 -t 8 -o megahit

2. Binning de contigs con Maxbin

Una muestra

$ perl run_MaxBin.pl -contig megahit/final.contigs.fa -out maxbin -thread 12 -reads R1.fastq -reads2 R2.fastq

Varias muestras

Si tenemos varias muestras en diferentes carpetas, cada una con sus archivos pareados fastq o también con fasta, podemos primero crear una lista de archivos para suministrárselos a Maxbin:

$ find . -name *.fastq > fastq_file.list

Corremos Maxbin con esta lista como entrada:

$ /opt/MaxBin-2.2.6/run_MaxBin.pl -contig megahit/final.contigs.fa -out maxbin -reads_list fastq_file.list  -thread 8 -plotmarker

Aquí le estamos pidiendo a Maxbin que:

• Utilice los contigs generados con Megahit ( -contig megahit/final.contigs.fa)
• Los archivos de salida llevan el prefijo maxbin (-out maxbin)
• Usa la lista de archivos (-reads_list fastq_file.list)
• Usa 8 núcleos para el proceso (-thread 8)
• Genera gráficos de cada MAG (-plotmarker)

Todos los archivos de salida los pone en el directorio donde estamos por lo que es conveniente juntarlos en un subdirectorio:

$ mkdir maxbin

$ mv maxbin.* maxbin/

Los bins generados pueden ser importados a Anvi'o haciendo un nuevo archivo delimitado por tabuladores (.tsv) que tenga en la primer column el nombre del contig y en la segunda el nombre del bin. Ésto se puede hacer fácilmente con un script que obtenga los contigs y el nombre de cada archivo fasta generado por Maxbin:

#!/bin/bash

# A simple script to convert maxbin results to anvio

FILES=$(find *.fasta)

for f in $FILES; do

  NAME=$(basename $f .fasta)

 grep ">" $f | sed 's/>//' | sed -e "s/$/\t$NAME/" | sed 's/\./_/' >> maxbins4anvio.tsv

done

En el directorio donde lo ejecutemos sólo deben estar los archivos con terminación .fasta generados por Maxbin; crea un nuevo archivo llamado maxbins4anvio.tsv

Ya que tenemos este archivo, podemos importarlo a nuestro profile de Anvi'o, para mas detalles de como obtener este profile checar aquí, el comando de anvio a usar es:

$ anvi-import-collection maxbins4anvio.tsv -p SAMPLES-MERGED/PROFILE.db -c contigs.db -C Maxbin --contigs-mode

Y para visualizar esta colección de MAGs ya en anvio:

anvi-interactive -c contigs.db -p SAMPLES-MERGED/PROFILE.db --collection-name Maxbin

3. Anotación de genomas con Prokka (opcional).

Con Maxbin se pueden haber generado MAGs y éstos pueden anotarse con Prokka:

$ prokka maxbin/maxbin.001.fasta --outdir prokka