Pasos de Anvi'o

Mapping

El siguiente paso implica mapear cada una de las secuencias a los contigs previamente generados para cada muestra. A partir de este paso, ya utilizaremos el programa Anvi'o, por lo que hay que invocarlo de la siguiente manera:

$ source ~/virtual-envs/anvio-5.X/bin/activate

Notar que ahora anted del prompt debe aparecer (anvio-5.5) que nos señala que ya estamos en el virtual environment de Anvi'o, versión 5.5 en este caso.

1. Primero necesitamos crear un índice de los contigs con bowtie:

$ bowtie2-build contigs.fa contigs

2. Después ya mapear:

$ bowtie2 --threads N -x contigs -r sample1.fna -S sample1.sam

o si tenemos fastq pareados:

$ bowtie2 --threads N -x contigs -1 Sample1.R1.fastq -2 Sample1.R2.fastq -S sample1.sam

en --threads hay que especificar cuantos núcleos se usarán, se pueden poner 8; -r es el nombre de la muestra que se va a mapear y la salida (-S) el mismo nombre pero con terminación .sam

3. Convertir de formato sam a bam:

$ samtools view -F 4 -bS sample1.sam > sample1_raw.bam

4. Inicializar los archivo bam con Anvi'o:

$ anvi-init-bam sample1_raw.bam -o sample1.bam

Nota: Es necesario repetir del paso 2 al 4 para cada muestra que tengamos.

5. Limpieza de archivos innecesarios:

$ rm sample1.sam sample1_raw.bam

Database

Ahora tenemos que crear una base de datos de los contigs:

$ anvi-gen-contigs-database -f contigs.fa -o contigs.db

Posteriormente es buena idea buscar hidden Markov models (hmm) en nuestros contigs:

$ anvi-run-hmms -c contigs.db --num-threads 12

Taxonomía

El siguiente paso es asignarle una taxonomía a cada gen encontrado en los contigs, primero tenemos que generar un archivo con los genes:

$ anvi-get-dna-sequences-for-gene-calls -c contigs.db -o gene-calls.fa

Luego buscar estos genes a que taxon pertenecen con Centrifuge:

$ centrifuge -f -x /db2/centrifuge/p_compressed+h+v gene-calls.fa -S centrifuge_hits.tsv

o mejor aún, con kaiju, considerar que para Kaiju tenemos varias bases de datos, la mas completa, y que tarda mas (una media hora), es la que tienen secuencias de bacterias, virus, arqueas, y micro eucariontes (protistas):

$ /opt/kaiju-v1.7.2-linux-x86_64-static/bin/kaiju -t /db2/kaiju_dbs/nr_euk/nodes.dmp -f /db2/kaiju_dbs/nr_euk/kaiju_db_nr_euk.fmi -i gene-calls.fa -o gene-calls.out -v -z 8

$ /opt/kaiju-v1.7.2-linux-x86_64-static/bin/kaiju-addTaxonNames -i gene-calls.out -t /db2/kaiju_dbs/nr_euk/nodes.dmp -n /db2/kaiju_dbs/nr_euk/names.dmp -o gene-calls.tax -r superkingdom,phylum,order,class,family,genus,species

Y finalmente importar los datos a nuestra base de datos de los contigs:

$ anvi-import-taxonomy -c contigs.db -i gene-calls.tax -c contigs.db -p kaiju --just-do-it

Funciones

Ahora necesitamos anotar funciones a los genes, para lo cual usamos la base de datos COGS de NCBI

$ anvi-run-ncbi-cogs -c contigs.db --num-threads 8 --cog-data-dir /databases/NCBI/COGS

Profile

Teniendo ya todos los datos, debemos crear un "profile" para cada muestra:

$ anvi-profile -i sample1.bam -c contigs.db --output-dir DIR --sample-name NAME -T 12 (--cluster-contigs  SI ES SOLO CONTIGS Y NO HAY SECUENCIAS)

   DIR puede ser el nombre de la muestra

   NAME puede ser también el nombre de la muestra

Debemos juntar todos los profiles de las muestras:

$ anvi-merge samples/*/PROFILE.db -o SAMPLES-MERGED -c contigs.db --sample-name NAME

Metadata

Ya por último podemos importar a la base de datos información de las muestras; esta info debe estar en un archivo delimitado por tabuladores.

$ anvi-import-misc-data additional_data.txt -p SAMPLES-MERGED/PROFILE.db  --target-data-table layers

Este archivo debe tener en la primer columna el nombre de las muestras exactamente igual que como se usaron en los fastq, la primer línea debe tener el nombre de la columna:

SAMPLE  SHRIMP TREATMENT

S04 04 Soy

C08 08 Control

P08 08 Chicken

P18 18 Chicken

S19 19 Soy