Tubulin purification
重要！
ブタ脳は近隣の屠畜場で屠畜後すぐ（まだ温かいもの）を購入後、すぐに冷やして研究室まで運ぶこと。屠畜してからの最初の重合開始までを出来るだけ手早く行うことが、よいチューブリンを得る決め手。
Saline solution
NaCl 9 g/L
DB buffer (pH6.6)
50 mM Mes
1 mM CaCl2
PB buffer (pH6.8)
100 mM Mes
0.5 mM MgCl2
1 mM EGTA
HMPB buffer (pH6.9)
1 M PIPES
1 mM MgCl2
20 mM EGTA
※全てAutoclaveしておく
精製操作
(あらかじめ食塩水、DB buffer、ミキサーを冷やしておく)
氷上で冷やしたブタ脳を5～10個用意
↓
低温室にてブタ脳表面の血管を除き、食塩水で洗う
↓
ブタ脳 + DB buffer (等量)でミキサー強 x3回
↓
2重に折りたたんだガーゼでこす
↓
(あらかじめグリセロール、HMPB buffer、ローター、チューブを温めておく)
上清 + グリセロール (等量) + HMPB buffer (等量) + 200 mM GTP (終濃度0.5 mM) + 100 mM ATP (終濃度1.5 mM)をよく攪拌し、チューブに分注、
バランスを合わせる
↓ 44 krpm, 30 min, 37℃
(あらかじめローターを冷やしておく)
上清を捨て、DB bufferを加えてピペッティングにより沈澱を壊した後(泡立てない!!)、溶液を合わせてチューブに分注、バランスを合わせる (on ice)
↓ 30 krpm, 30 min, 4℃
(あらかじめグリセロール、HMPB buffer、ローター、チューブを温めておく)
上清 + グリセロール (等量) + HMPB buffer (等量) + 200 mM GTP (終濃度0.5 mM) + 100 mM ATP (終濃度1.5 mM)をよく攪拌し、チューブに分注、バランスを合わせる
↓ 44 krpm, 30 min, 37℃
(あらかじめRB buffer、ローターを冷やしておく)
上清を捨て、RB bufferを加えてピペッティングにより沈澱を壊した後(泡立てない!!)、溶液を合わせてチューブに分注、バランスを合わせる
↓ 30 krpm, 30 min, 4℃
上清をエッペンに分注し、-80℃保存
タンパク定量、SDS-PAGEにて確認