BioRazetti - PCR y Secuenciación de Fragmentos de ADN

PCR y Secuenciación de fragmentos de ADN

Reacción en cadena de la polimerasa

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una herramienta tecnológica utilizada para el estudio de los ácidos nucleícos, caracterizada por ser una técnica de alta sensibilidad, reproducibilidad y eficiencia, que genera resultados verídicos en cortos períodos de tiempo y que son sencillos de examinar. Por esto, se ha convertido para muchos investigadores en uno de los mejores métodos para los estudios genéticos y de biología molecular. Por otra parte, la PCR es una reacción enzimática in vitro que permite la amplificación de una secuencia especifica de ADN, durante varios ciclos consecutivos, en donde la secuencia seleccionada es copiada fielmente, todo esto por medio de un aparato especifico para esta reacción llamado termociclador. Mediante esta técnica se logra la detección rápida y confiable de los marcadores genéticos de una gran variedad de enfermedades infecciosas, cáncer y desórdenes genéticos.^.1^,²

Para que se dé la reacción de la PCR se necesitan ciertos factores que son cruciales para su desarrollo, entre ellos está la enzima ADN polimerasa, que tiene la capacidad de sintetizar naturalmente el ADN en las células, y permite la amplificación repetida de porciones deseadas del ADN, de esta enzima se utiliza un análogo bacteriano llamado Taq ADN polimerasa, que proviene de una bacteria termófila llamada thermus aquaticus debido a sus condiciones de vida en temperatura muy altas. Otros elementos importantes en esta reacción son la hebra templado o molde (ADN o ADNc), los oligonucleótidos o primers (secuencias de nucleótidos cortos situados a cada lado del ADN de interés, también denominados secuencias franqueantes, deben tener un tamaño que oscile entre 15-25 pares de bases), los desoxiribonucleotidos trifosfatados (dNTPs: adenina, timina, citosina y guanina), el ion magnesio (Mg+), una solución amortiguadora o buffer y H2O.¹^,²

En cada ciclo de la PCR se duplica la cantidad de ADN de la muestra obtenida, lo que provoca un aumento considerable del ADN con ciclos repetidos de amplificación. Estos ciclos se dividen en las reacciones expuestas en el siguiente cuadro y son representadas en la figura 1:¹

Esquema realizado María LeónInformación extraída de Fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real.

Pasos de un ciclo de la PCR. Esquema elaborado por Diego Martínez (adaptado para mejor lectura). Disponible en: Fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real.

Al final de la reacción, para confirmar si se amplifico la secuencia de interés, los llamados amplicones, son analizados con una electroforesis en gel de agarosa (anexo 2), una hibridación de Southern o con una determinación directa de la secuencia.¹^,

Electroforesis en gel de agarosa.Imagen tomada de Medigraphic.

Video sobre la PCR.Tomado del canal Desde Mendel Hasta Las Moléculas.

Aplicaciones de la PCR

La PCR es un método simple, muy versátil que puede utilizarse en diferentes aplicaciones médicas que requieran una elevada cantidad de un fragmento de ADN específico. Hoy en día se sabe que la PCR se puede aplicar en diferentes áreas de las ciencias biológicas y en las ciencias de la salud, formando así parte importante del quehacer científico de la mayoría de los laboratorios de investigación, que la utilizan para expresión génica, detección de patógenos y análisis de mutaciones.^{2, 3}

Debido a que esta prueba permite el diagnóstico de enfermedades genéticas y/o mutaciones en fragmentos de ADN provenientes de muestras variadas la prueba ideal que se pudo realizar en el este caso clínico antes presentado, ya que, la paciente presentaba antecedentes de Diabetes Mellitus y presentó en sus 2 embarazos alteraciones en los niveles de glucosa, donde se le diagnosticó una posible diabetes gestacional. Al realizarse esta prueba se detectó la mutación c. 1268t>A, p.Phe423Tyr ubicada en el brazo corto del cromosoma 7, específicamente en el exón 10 del gen de la glucoquinasa (GCK) diagnosticándose finalmente, una diabetes Mellitus tipo MODY 2; este es un tipo de diabetes con características de diabetes tipo 2, que por lo general se presenta en pacientes jóvenes menores de 25 años de edad.^{4, 5}

Secuenciación de Fragmentos de ADN

La secuenciación de fragmentos de ADN es una técnica que se realiza de manera conjunta con la PCR y al día de hoy se ha utilizado para secuenciar una gran cantidad de ADN con información de importancia médica, ecológica, fisiológica y evolutiva. En 1977 surgieron dos técnicas revolucionarias en el campo de la secuenciación de ADN: la secuenciación química de Maxam y Gilbert y la secuenciación enzimática de Sanger.⁶

La técnica enzimática de Sanger se basa en la interrupción regulada de la replicación del ADN in vitro. Previa a esta técnica se realiza una PCR del fragmento deseado pero, distinguiéndose de una PCR normal, se agregan dideoxinucleótidos (ddNTPs), quienes carecen del grupo hidroxilo en el extremo 3’ y están marcados con fluoróforos o con radioactividad. Al incorporarse un ddNTPs a la cadena de ADN en elongación (por PCR), se detiene la amplificación, de tal forma que al terminar, se tienen fragmentos que difieren en su longitud, cada uno terminando en ddNTPs. Las secuencias obtenidas se separan y analizan electroforéticamente de manera manual o automática. Gracias al desarrollo de este tipo de técnicas actualmente se tiene una gran cantidad de información en el campo de la genómica con aplicaciones innumerables. Entre otras cosas, las secuenciación permite la asociación de enfermedades con la variabilidad genética, la función de genes, el patrón de expresión de genes nuevos, la similitud o variación genética entre especies diferentes, entre otros.⁶

Secuenciación química de Maxam-Gilbert.Imagen extraida de "Secuenciación de Fragmentos de ADN" (pdf disponible aquí)

Fragmentos de ADN obtenidos después la secuenciación de fragmentos de ADN por la técnica de Sanger .Imagen extraída de "Secuenciación de Fragmentos de ADN" (PDF disponible aquí)

Bibliografía

1- De dios, T. Ibarra, C. Velasquillo, C. Fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real. Rev Investigación en discapacidad [Internet]. 2013 [2020]; Vol 2 (2):pp 70-78. Disponible en: https://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2013/ir132d.pdf

2- Harvey, Richard A. & Champe, Pamela C. (2006). Bioquímica. 3ra edición. México: McGraw-Hill Interamericana.

3- Mauricio J. Farfan. Biología molecular aplicada al diagnóstico clínico. REV. MED. CLIN. CONDES [Internet]. 2015 [2020]; 26 (6):pp 188-793. Disponible en: https://www.researchgate.net/publication/289997025_BIOLOGIA_MOLECULAR_APLICADA_AL_DIAGNOSTICO_CLINICO

4- Dexeus C. Diabetes tipo MODY - Diabetes tipo MODY | Endocrinología y Nutrición Hospital Quirón Dexeus Barcelona [Internet]. Endocrino.cat. 2020 [cited 5 July 2020]. Available from: http://www.endocrino.cat/es/diabetes.cfm/ID/7696/ESP/diabetes-tipo-mody.htm#:~:text=%C2%BFQu%C3%A9%20es%20la%20diabetes%20tipo,antes%20de%20los%2025%20a%C3%B1os

5- Leticia Sánchez-Reyes et al. Actualización en los diferentes subtipos de diabetes tipo “MODY”. Rev endocrinología y nutrición [Internet]. 2001 [2020]; 9 (1):pp 5-11. Disponible en: https://drive.google.com/drive/u/0/folders/1nlLz-HRRaFfWMo2P9jpVytZ7TyUnCn9y

6- Márquez, L. Serrato, A. Cerritos, R. Secuenciación de fragmentos de ADN. [Internet]. [25/7/2020]; pp 231-249. Disponible en: http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/secuenciacion.pdf

Este artículo fue redactado por:

Maria Leon

Daniel Landaeta

Giovanny Mangia