薬剤標的タンパク質の探索による薬剤作用機序の解明
Discovery of Proteins as Drug Targets and the Mechanisms they Control
しばしば社会的に大きな問題となる医薬品の副作用の原因として、薬剤が主作用となる標的タンパク質以外のタンパク質と相互作用することが原因の１つと考えられます。薬剤と相互作用する標的タンパク質の網羅的な探索は、医薬品の主作用・副作用機序の解明や適応拡大など創薬に大いに役立つことが期待できます。
そこで、私たちの研究室では、mRNA ディスプレイ法を用いて、ビーズに固定した薬剤に結合するタンパク質を cDNA ライブラリーから網羅的に探索し、その分子作用機序を解析しています (図７＆８)。
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図７ 免疫抑制剤 FK506 の新規結合タンパク質の探索
mRNA ディスプレイ法によりヒト cDNA ライブラリーから薬剤 FK506 に結合するタンパク質を探索した結果、主作用に関わる既知の結合タンパク質 FKBP12 の他に、新規の結合タンパク質として神経変性疾患の原因遺伝子の１つである Spartin を試験管内選択することに成功し、この薬剤-タンパク質相互作用が神経細胞における脂質代謝に及ぼす影響の一端を明らかにした。
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図８ mRNA ディスプレイ法による薬剤結合タンパク質の試験管内選択
(1) ヒト cDNA ライブラリーから転写した mRNA の 3' 末端に PEG スペーサーを介してピューロマイシンを連結する。(2) これを鋳型として無細胞翻訳反応を行うことにより、(3) ヒトタンパク質とそれをコードする mRNA とがリボソーム上で連結する。(4) この mRNA-タンパク質連結分子ライブラリーをビーズに固定した薬剤と結合させ洗浄後、(5) ビーズに残ったタンパク質の遺伝子 mRNA を逆転写 (RT) PCR により増幅する。(6) 得られた DNA を鋳型として上記 (1) から (5) のステップを繰り返す。(7) 最終的に濃縮された遺伝子の塩基配列を解読し、薬剤と結合するタンパク質を同定する。
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また、mRNA ディスプレイ法や DNA ディスプレイ法は、ランダムペプチドライブラリーからの疾患標的タンパク質に結合する薬剤リードペプチドの探索にも利用されています。
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これまでの研究業績
Nagata, T., Shirakawa, K., Kobayashi, N., Shiheido, H., Tabata, N., Sakuma-Yonemura, Y., Horisawa, K., Katahira, M., Doi, N., Yanagawa, H. Structural basis for inhibition of the MDM2:p53 interaction by an optimized MDM2-binding peptide selected with mRNA display. PLoS ONE 9, e109163 (2014)
Tokunaga, M., Shiheido, H., Hayakawa, I., Utsumi, A., Takashima, H., Doi, N., Horisawa, K., Sakuma-Yonemura, Y., Tabata, N., Yanagawa, H. Hereditary spastic paraplegia protein spartin is an FK506-binding protein identified by mRNA Display. Chem. Biol. 20, 935-42 (2013)
Tokunaga, M., Shiheido, H., Tabata, N., Sakuma-Yonemura, Y., Takashima, H., Horisawa, K., Doi, N., Yanagawa, H. MIP-2A is a novel target of an anilinoquinazoline derivative for inhibition of tumor cell proliferation. PLoS ONE 8, e76774 (2013)
土居信英, 柳川弘志. 進化分子工学による新規タンパク質の創出とプロテオミクスへの応用.「進化分子工学 ～高速分子進化によるタンパク質・核酸の開発～」(伏見譲編) NTS出版, pp. 275-86 (2013)
Shiheido, H., Naito, Y., Kimura, H., Genma, H., Takashima, H., Tokunaga, M., Ono, T., Hirano, T., Du, W., Yamada, T., Doi, N., Iijima, S., Hattori, Y., Yanagawa, H. An anilinoquinazoline derivative inhibits tumor growth through interaction with hCAP-G2, a subunit of condensin II. PLoS ONE 7, e44889 (2012)
Shiheido, H., Terada, F., Tabata, N., Hayakawa, I., Matsumura, N., Takashima, H., Ogawa, Y., Du, W., Yamada, T., Shoji, M., Sugai, T., Doi, N., Iijima, S., Hattori, Y., Yanagawa, H. A phthalimide derivative that inhibits centrosomal clustering is effective on multiple myeloma. PLoS ONE 7, e38878 (2012)
Doi, N., Yamakawa, N., Matsumoto, H., Yamamoto, Y., Nagano, T., Matsumura, N., Horisawa, K., Yanagawa, H. DNA display selection of peptide ligands for a full-length human G protein-coupled receptor on CHO-K1 cells. PLoS ONE 7, e30084 (2012)
Matsumura, N., Tsuji, T., Sumida, T., Kokubo, M., Onimaru, M., Doi, N., Takashima, H., Miyamoto-Sato, E., Yanagawa, H. mRNA display selection of a high-affinity, Bcl-XL-specific binding peptide. FASEB J. 24, 2201-10 (2010)
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おもな研究資金
2005 年度 科学技術振興機構 シーズ育成試験「DNA ディスプレイによる受容体の効率的なリガンド探索技術の開発」(土居信英)
2002-2004 年度 NEDO 大学発事業創出実用化研究開発事業「ゲノム創薬のためのターゲット遺伝子探索技術の開発」(柳川弘志)
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