La electroforesis es una técnica que favorece el transporte de los fragmentos de ADN amplificados a través de un disolvente mediante un campo eléctrico [6]. El campo eléctrico está compuesto por un cátodo (+) y un ánodo (-) conectados a una fuente de alimentación eléctrica que suministra un voltaje regulado, que propicia el desplazamiento de las moléculas dentro de un gel de agarosa.
Debido a que el ADN posee carga negativa por la presencia de los grupos fosfato que componen a la molécula [7], este se movilizará hacia el cátodo (+) de la cámara de electroforesis. Por consiguiente, la velocidad con la que se moverá el ADN dentro del gel estará asociada al tamaño (pares de bases) del fragmento amplificado.
La electroforesis consta de 4 fases importantes: la preparación del gel de agarosa, la carga del ADN y el marcador de peso molecular, la corrida del gel con voltaje regulado y la interpretación del resultado que confirmará la presencia o la ausencia del fragmento a identificar.
Equipo:
Microondas o baño maría
Camara de electroforesis
Transiluminador
Reactivos:
TAE o TBE 1X
Agarosa
Bromuro de etidio
Marcador de peso molecular
Procedimiento:
Después de la amplificación por PCR, se debe preparar un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio (200 a 500 ng/ml), en amortiguador TAE o TBE 1X. El porcentaje o concentración de agarosa depende del tamaño en pares de bases (pb) esperado, por ejemplo; para muestras de 100-300 pb se recomienda usar un gel al 1.0 % de concentración, a continuación se enlistan el material utilizado y los pasos para su preparación:
1.Preparación de agarosa en buffer TAE/TBE 1X
Pesar 0.25 gramos de agarosa (consultar el peso molecular de la presentación comercial), posteriormente se deberá mezclar la agarosa y el buffer TAE o TBE 1X. Esto se puede realizar con ayuda de un matraz.
Para disolver la agarosa se recomienda calentar la solución en el microondas o baño maría, mezclando ocasionalmente, para propiciar una solución íntegra, es decir hasta observar que la solución sea totalmente transparente.
Finalmente se añade bromuro de etidio u otro colorante para teñir el gel, esto permitirá la visualización del ADN bajo luz UV. Si se usa bromuro de etidio (200 a 500 ng/ml), agréguese cuando la solución esté caliente pero no hirviendo (aproximadamente entre 50-60 °C), manteniendo por seguridad el uso de guantes.
Consideraciones: Para fragmentos de ADN pequeños regularmente se usan geles de agarosa a una concentración que varía entre el 1.5 % a 2.0 %, en contraste con el tamaño de fragmentos de ADN grandes en donde se utilizan geles que varían entre el 0.8 % al 1.0 % de concentración.
Las muestras se cargan en los pozos del gel de agarosa. En el primer carril se coloca un marcador de peso molecular, que sirve como escala de referencia. Posteriormente, se carga el producto de PCR de cada muestra analizada en los pozos correspondientes.
Se aplica corriente eléctrica a la cámara, lo que permite que el ADN, debido a su carga negativa, se desplace hacia el electrodo positivo. De este modo, los fragmentos más pequeños viajan más rápido que los más grandes, separándose según su tamaño o peso molecular.
Concideración: El voltaje aplicado a la cámara de electroforesis debe contemplar el tamaño del fragmento que se espera identificar, por lo cual es importante regular adecuadamente el tiempo y la energía aplicada durante el proceso.
Los resultados se visualizan colocando el gel en un transiluminador, la exposición con luz UV, revela las bandas de ADN. Estas bandas indican la presencia y el tamaño de los fragmentos amplificados.
6. Feifelder D. (2003). Serie de Biología fundamental: Técnicas de bioquímica y biología molecular (1° edición). Reverte S.A.
7. Reiner Westermeier. 2004. Electrophoresis in Practice: A Guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations. Wiley‐VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. https://doi:10.1002/3527603468