Evaluación de las Concentraciones del Calcio Intracelular en los Espermatozoides
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A lo largo de su recorrido por el tracto reproductivo femenino, los espermatozoides deben atravesar un entorno complejo y desafiante antes de llegar al sitio de fertilización. Entre estos desafíos se encuentran barreras físicas y químicas, como: el moco cervical viscoso, las contracciones uterinas y los numerosos pliegues del oviducto, que en conjunto dificultan su avance hacia el sitio de fertilización.
Imagen 1. Tomado de representación 3D de espermatozoides y óvulos microscópicos [Fotografía], por Kavic.C´s Images, s.f., CANVA (https://www.canva.com/photos/MAEhCcz1U-E/)
Para superar estos obstáculos y aumentar sus probabilidades de éxito, los espermatozoides deben modificar su patrón de motilidad, pasando de un movimiento activado a uno hiperactivado. Este cambio en el batido flagelar es esencial para que puedan nadar de manera progresiva a través del medio viscoso, desprenderse del epitelio oviductal y, eventualmente, llegar al sitio de fertilización para encontrarse con el ovocito [1].
La motilidad hiperactivada es altamente regulada por mecanismos bioquímicos y depende, en gran medida, del aumento de las concentraciones intracelulares de calcio [2]. Este incremento desencadena cambios en la dinámica del batido flagelar, haciendo que el movimiento del flagelo sea más vigoroso, asimétrico y de gran amplitud [3]. Dichas modificaciones en la motilidad son fundamentales para el desplazamiento de los espermatozoides en entornos complejos.
Fundamento para la Medición de Calcio Intracelular
Imagen 2. Incremento del calcio intracelular en espermatozoides de bovino. Se observa el incremento de la fluorescencia en la región de la cabeza y el flagelo de los espermatozoides. Fuente [Original]
Para medir las concentraciones intracelulares de calcio en los espermatozoides, se emplean sondas fluorescentes diseñadas específicamente para detectar este ion. Estas sondas, comúnmente conocidas como colorantes fluorescentes, que se unen selectivamente al calcio y emiten una señal de fluorescencia cuya intensidad varía en función de la cantidad de calcio presente en la célula.
El análisis de los niveles de calcio intracelular es una herramienta fundamental en el estudio de la fisiología espermática, ya que no solo permite cuantificar su concentración, sino también evaluar sus cambios dinámicos en respuesta a distintos estímulos fisiológicos. Dado que el calcio actúa como un segundo mensajero clave en las vías de señalización que regulan la hiperactivación espermática [2], su medición proporciona información valiosa sobre la funcionalidad y calidad de los espermatozoides en cualquier especie animal.
Materiales
Equipo
Microscopio invertido con controlador de temperatura. Fuente de iluminación LED y acoplado a una cámara CCD
Termoblock
Centrífuga
Instrumentos
Cámara de registro
Cubreobjetos redondos
Micropipetas de volúmenes variables
Puntas para micropipetas
Reactivos
Colorante Fluo 3 AM
Concavalina
Ionomicina
Quelante de calcio
Medio TALP
Procedimiento:
1.Adición del colorante Fluo-3 AM.
Primeramente, se deberá añadir el colorante Fluo-3 AM a una concentración final de 2 µM. La concentración de espermatozoides deberá ajustarse a 10 millones de células por mililitro.
2. Incubación en oscuridad.
2. Incubación en oscuridad.
Posteriormente, se deberá incubar a los espermatozoides durante 30 minutos a temperatura constante (37 a 39 °C) para favorecer el ingreso del colorante al interior de las células.
Consideración: Es fundamental realizar esta incubación en oscuridad para evitar el fotoblanqueo de las células debido a la exposición de la luz natural o artificial.
3. Centrifugación.
3. Centrifugación.
Tras finalizar la incubación, la muestra se tendrá que centrifugar durante 5 minutos a 300 g, esto permitirá eliminar el exceso de colorante que no se haya incorporado al interior de los espermatozoides.
4. Retiro de sobrenadante.
4. Retiro de sobrenadante.
Posterior a la centrifugación se deberá retirar mediante pipeteo el sobrenadante de la solución que llevará el colorante extracelular.
Posterior a la centrifugación se deberá retirar mediante pipeteo el sobrenadante de la solución que llevará el colorante extracelular.
5. Resuspensión celular.
Enseguida la muestra deberá ser resuspendida con el medio de mantenimiento TALP, el volumen del medio puede variar, dependiendo de la concentración deseada de los espermatozoides.
6. Pegado de las células en suspensión con medio TALP.
Seguido de esto se preparan cubreobjetos redondos recubiertos con concanavalina, para facilitar la adhesión de los espermatozoides. Esto permitirá dar seguimiento de los cambios en los niveles de calcio intracelular durante el tiempo que dura el registro, independientemente de la adición de otros compuestos.
7. Evaluación de las concentraciones de calcio intracelular.
La cámara de registro se coloca sobre la platina de un microscopio invertido con control de temperatura. La muestra se enfoca utilizando un objetivo de 60X. Se añade medio TALP para mantener a las células en suspensión. A partir de este punto se puede iniciar el monitoreo de los cambios en las concentraciones de calcio intracelular (Figura 1).
Figura 1. Representación gráfica de un microscopio invertido adaptado a un set de imagen para la evaluación de las concentraciones de calcio intracelular. Fuente [Original].
Resumen Gráfico del Procedimiento
¿Cómo funciona el sistema para monitorear los cambios en las concentraciones del calcio intracelular de los espermatozoides?
La evaluación en los cambios de la fluorescencia, se realiza en un set de imágenes (Figura 1) bajo oscuridad, mediante una fuente de iluminación LED. Esta fuente excita al fluorocromo (molécula fluorescente) del Fluo-3 AM a una longitud de onda de 480 nm. La iluminación, acoplada a un microscopio invertido, llega a la muestra a través de un sistema de filtros que permite recuperar la luz emitida por el fluorocromo, 525 nm. Además, el sistema incluye un software especializado que regula la intensidad y la frecuencia del suministro de luz a la muestra. Las imágenes (frames) que conforman al video, se obtienen mediante una cámara CCD integrada al sistema (Figura 2). Finalmente, la señal se envía a una computadora, donde las imágenes pueden recuperarse en tiempo real.
Figura 2. Configuración interna del microscopio para la visualización de la fluorescencia. Adaptado de Chavéz et al.,2020 (4).
Referencias:
Nishigagaki, T., Romero, F., & Sánchez-Guevara, Y. (2016). CatSper, el canal de Ca2+ que regula el batido flagelar del espermatozoide en eucariontes. Revista Iberoamericana de Ciencias, 3(3). https://doi.org/10.1242/jeb.127662.
Darszon, A., Nishigaki, T., Beltran, C., & Treviño, C. L. (2011). Calcium Channels in the Development, Maturation, and Function of Spermatozoa. Physiological Reviews, 91(4), 1305-1355. https://doi.org/10.1152/physrev.00028.2010
Suarez, S. S. (2008). Control of hyperactivation in sperm. Human Reproduction Update, 14(6), 647-657. https://doi.org/10.1093/humupd/dmn029
Chávez, J. C., Darszon, A., Treviño, C. L., & Nishigaki, T. (2020). Quantitative Intracellular pH Determinations in Single Live Mammalian Spermatozoa Using the Ratiometric Dye SNARF-5F. Frontiers In Cell And Developmental Biology, 7. https://doi.org/10.3389/fcell.2019.00366
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