Paso 1. Extracción de ADN genómico
Paso 1. Extracción de ADN genómico
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El primer paso para genotipificar animales consiste en la obtención del ADN a partir de un tejido procedente de la cola, oreja y/o de células sanguíneas o exfoliadas de las mucosas del animal seleccionado. El ADN extraído de una muestra, puede mantenerse en conservación (-20 °C), durante algunos meses para ser aprovechado según las necesidades de los analistas.
La muestra obtenida del animal se somete a un proceso de lisis celular que involucra la ruptura de las membranas celulares y propicia la liberación del ADN genómico de la muestra obtenida. Este procedimiento requiere de la participación de la proteinasa K, una enzima dependiente de calcio que se incuba por un tiempo determinado a altas temperaturas para digerir proteínas.
A continuación se detalla el procedimiento para extracción del ADN genómico de una muestra de ratón.
Materiales
Materiales
Reactivos:
Tris-HCl pH 8.0 (1 M)
KCl (0.5 M)
Tween 20 (10%)
Proteinasa K (10 mg/ml)
Equipo:
Centrífuga
Placa de agitación con temperatura controlada
Baño seco (thermoblock)
Procedimiento:
Procedimiento:
1.Toma de muestra:
Como primer paso se debe obtener una biopsia del tejido del animal que se desea analizar. El tamaño de la muestra debe ser de aproximadamente 0.3 centímetros (cm).
2. Conservación en frío
2. Conservación en frío
Colocar el tejido de cada animal en un tubo eppendorf de 0.6 mililitros (ml) y guardar en congelación a -20 °C. Si la extracción se lleva a cabo inmediatamente, el tejido deberá mantenerse en hielo.
Recomendación: Es importante identificar con un plumón indeleble cada tubo que contiene el tejido del animal que se analizará. Esto te permitirá obtener resultados confiables durante todo el análisis.
3. Adición de amortiguador e incubación
3. Adición de amortiguador e incubación
Adicionar 50 microlitros (µl) de amortiguador de lisis a una concentración 1X (ver tabla 1), esto se deberá realizar por cada muestra. Posteriormente las muestras se deben incubar durante 20 minutos a 95°C.
Consideración: El amortiguador de lisis 10X se mantiene a 4 °C por meses. Al diluir el amortiguador a la concentración 1X con agua destilada este deberá utilizarse en el lapso máximo de dos semanas.
4. Enfriamiento y centrifugación
4. Enfriamiento y centrifugación
Tras la lisis, es importante enfriar la muestra y separar los restos celulares del ADN. Esto se realiza a través de la centrifugación de la muestra a 13,000 g (fuerza centrífuga relativa, del inglés RFC) durante 30 segundos.
Este proceso tiene como finalidad sedimentar los restos celulares en el fondo del tubo, por lo que se deberá recuperar el sobrenadante para las siguientes etapas del protocolo.
5. Adición de la proteína K
5. Adición de la proteína K
Una vez obtenido el sobrenadante de cada muestra, se deberán adicionar 2.5 µl de proteinasa K a una concentración de 10 mg/ml, es importante mezclar para homogeneizar la solución. Este paso favorece la digestión de proteínas, asi como la liberación y purificación del ADN.
6. Incubación en agitación
6. Incubación en agitación
El siguiente paso es incubar cada muestra a 55 °C durante 5 horas en una placa agitadora a 350 revoluciones por minuto (rpm´s), para asegurar una digestión completa.
7. Aumento de temperatura
7. Aumento de temperatura
Al término de la incubación en placa de agitación, las muestras se deben calentar a 95 °C durante 5 minutos con el fin de desnaturalizar y eliminar cualquier contaminante restante.
8. Separación del ADN purificado
8. Separación del ADN purificado
Las muestras se centrifugan a máxima velocidad durante 20 minutos a 4 °C, con el objetivo de separar el ADN purificado de otros restos celulares.
9. Recuperación del ADN
9. Recuperación del ADN
Finalmente se recupera la fase acuosa (sobrenadante) que contiene el ADN genómico, el cual se almacena a -20 °C hasta su uso.
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