Procedimiento Para el Cultivo de Células
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A continuación, revisaremos el protocolo de pase o subcultivo celular de células Hek 293. El cual es un procedimiento esencial en el mantenimiento de cultivos celulares. Este proceso implica transferir células de un cultivo confluente a una nueva placa de cultivo para asegurar su crecimiento continuo y viabilidad [1]
Materiales
Equipo:
Campana de flujo laminar.
Incubadora de CO2
Microscopio óptico.
Instrumentos:
Pipetas estériles de 10 mL.
Pipeteador.
Micropipeta de 1000 µL.
Puntas azules (de 1 mL).
Placas de cultivo.
Rotulador.
Reactivos:
Placa de cultivo de células HEK-293 con 80% - 90% de confluencia.
TrypLE Express** 1x (o tripsina) para disociar las células.
PBS** 1x.
Medio de cultivo DMEM** complementado con 10% de suero fetal bovino y con 1% de antibiótico/antimicótico.
Etanol al 70 % como agente desinfectante.
Procedimiento:
1.Desinfección de campana.
El primer paso consiste en encender la campana y desinfectarla con etanol al 70%, 15 minutos antes de empezar.
2. Incubación de medios.
Incubar el medio de cultivo DMEM, el PBS y el TrypLE Express a 37°C (temperatura de incubación de las células).
Importante: El medio de cultivo, el TrypLE Express y el PBS se almacenan a temperatura de refrigeración, pero se llevan a 37°C antes de que entren en contacto con las células.
3. Rotulación con número de pase.
En una placa de cultivo de 35 milímetros nueva y estéril, deberá ser rotulada con el nombre de la línea celular, el número de pase, la fecha y el nombre o iniciales de la persona que los cultiva.
4. Adición del medio DMEM.
Se agregarán de 1.5 a 2 mililitros de medio DMEM, para posteriormente reservarlo.
5. Remoción del medio.
Se deberá remover el medio de cultivo viejo, evitando completamente tocar la monocapa de células, inclinando la placa y colocando la punta de la pipeta lo más cerca de la pared y no de la base.
6. Lavado con PBS.
El cultivo será lavado con un mililitro de PBS para remover las células muertas o detritos celulares. Siempre manejando por las paredes con suavidad y con el cuidado de no perturbar a la monocapa de células. En seguida se deberá agitar suavemente y remover el PBS con la pipeta.
7. Adición de TrypLE Express e incubación.
Posteriormente se añaden 250 µL de TrypLE Express para despegar las células, cuidando que se cubra bien la monocapa e inmediatamente después se lleva a una incubadora a 37°C durante 2 minutos.
8. Corroborar desprendimiento celular.
Concluidos los 2 minutos, se retiran las células de la incubadora, y se verifica que se estén desprendidas, para posteriormente llevarlas a la campana.
9. Adición de DMEM.
El siguiente paso consiste en agregar el medio de cultivo DMEM para detener la actividad enzimática, luego se pipetea para disgregar las células mecánicamente y completar la disociación celular.
10. Corroborar disociación celular.
Se tendrá que confirmar que las células están completamente separadas y esféricas observándose al microscopio.
11. Transferencia y distribución de células en placa de cultivo.
Tomar de 200 a 400 µL (entre el 10 y el 20 %) de suspensión celular con una micropipeta, para transferir estas células a la placa de cultivo preparada previamente con el medio de cultivo. Distribuirlas por goteo tratando de cubrir toda la placa de cultivo y homogeneizar la suspensión de células recién transferidas a la nueva placa por pipeteo. Se deberá agitar suavemente con movimientos circulares y en cruz para que las células se distribuyan en toda la placa.
12. Corroborar distribución homogénea.
Se deberá corroborar que las células esten distribuidas de manera homogénea en toda la placa, observándolas al microscopio.
13. Incubación.
Posteriormente se incuban a 37°C en una incubadora con 5% de CO2.
14. Monitoreo del cultivo.
Las células se monitorean a las 2 y a las 24 horas. A las 2 horas las células comienzan a pegarse a la base de la placa y a adquirir su forma más plana, alargada y con algunas proyecciones. A las 24 horas ya están completamente adheridas a la base y ya comenzaron a duplicarse, por lo que se observará mayor densidad celular con su morfología habitual.
Resumen Gráfico Completo
Relevancia de los Cultivos Celulares
El trabajo con cultivos celulares proporciona un control preciso sobre las condiciones ambientales que afectan el crecimiento celular, lo que permite una manipulación más eficiente en comparación con el mantenimiento de organismos completos. Esta técnica ofrece la ventaja de trabajar con tipos celulares específicos, facilitando el estudio detallado de procesos biológicos fundamentales como la división celular, la diferenciación, el metabolismo y la comunicación entre células. La versatilidad de los cultivos celulares los hace indispensables en diversas disciplinas científicas, incluyendo la farmacología, la genética, la inmunología y la ingeniería de tejidos. En particular, en la ingeniería de tejidos, se utilizan para crear estructuras celulares que replican la funcionalidad de órganos y tejidos humanos, lo que abre nuevas posibilidades para la medicina regenerativa. Este enfoque tiene aplicaciones innovadoras en áreas como el desarrollo de terapias de reemplazo celular y el estudio de enfermedades, ofreciendo perspectivas prometedoras para el avance de tratamientos médicos y la mejora de la calidad de vida de los pacientes.
Referencias:
Phelan, M. C. (2007). Basic techniques in mammalian cell tissue culture. Current Protocols in Cell Biology, 36, 1.1.1-1.1.18. https://doi.org/10.1002/0471143030.cb0101s36
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