El análisis microscópico se centra en el estudio de parámetros relacionados con los espermatozoides. Este examen puede realizarse tanto en eyaculados frescos como en semen criopreservado. Algunos de los parámetros evaluados incluyen la concentración, la vitalidad, la morfología y la motilidad espermática.

El protocolo puede llevarse a cabo con semen en su forma original, compuesto por todos sus fluidos, o con semen previamente procesado in vitro, del cual se ha eliminado el plasma seminal y los restos celulares.

Los métodos más utilizados para la selección espermática son: 1) el método swim-up, basado en la capacidad de los espermatozoides para nadar de forma ascendente en un medio de mantenimiento, y 2) el método de gradiente de densidad (Figura 2), que emplea diferentes densidades para separar gradualmente la fracción de espermatozoides móviles de los inmóviles.

A continuación, se describe el método de selección de espermatozoides por gradiente de densidad, seguido del conteo espermático para determinar la concentración celular en una muestra.

1. Preparación del gradiente: el gradiente se compone de dos densidades, una de mayor densidad 80% y otra de menor densidad del 40%, en este caso usaremos un gradiente comercial (Figura 2), sin embargo se puede utilizar un gradiente preparado a base de percoll.

2. Centrifugación del gradiente: En un tubo cónico de 1 ml se debe colocar el gradiente de mayor densidad (80%), seguido de la colocación del gradiente de menor densidad del (40%). Finalmente sobre la fracción superior de ambas densidades se deberá colocar la muestra de semen que se desea separar. El gradiente se centrifuga durante un periodo que puede oscilar entre los 25 a 30 minutos a 300 g. Posteriormente por pipeteo circular se remueve el sobrenadante y el pellet se resuspende en medio TALP, el volumen puede variar dependiendo de la concentración de espermatozoides deseada en la muestra (Figura 3). 

3. Resuspensión de la muestra: Una vez concluida la centrifugación se tendrá que retirar todo el sobrenadante con el uso de una micropipeta, evitando tocar el pellet formado en el fondo del tubo. Como siguiente paso el pellet deberá ser re-suspendido en un medio de mantenimiento, cuya composición puede variar según los requisitos del análisis, en este caso, se emplea el medio TALP (Figura 3). 

1. El conteo de la concentración de espermatozoides requiere de una cámara de conteo que puede ser Makler o de Neubauer (para conteo de eritrocitos). En el caso de la cámara Makler se depositan aproximadamente 10 microlitros de la muestra, con ayuda de una micropipeta. 

2. Posteriormente se coloca sobre la platina del microscopio, observándose con el objetivo 10X (Figura 4) . 

3. Se cuentan los espermatozoides de tres líneas cuadriculadas, que abarcan un total de 30 cuadros, y se calcula el promedio de los espermatozoides contados en las tres líneas, multiplicado por el volumen total de espermatozoides que componen a la muestra. El resultado se expresa en millones de espermatozoides por ml, por ejemplo: 24 x 10^6  células/ml.