Paso 2. Transformación Bacteriana por Choque Térmico
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Imagen 1. Diagrama de la estructura de un plásmido.
Adaptado de Morgan, K. (2020). A plasmid map showing the standard features of a plasmid. [Fotografía]. Addgene. https://blog.addgene.org/plasmid-101-origin-of-replication
El protocolo básico de transformación bacteriana por el método de calcio, es un procedimiento sencillo que puede llevarse a cabo en un laboratorio de enseñanza que cuenta con las condiciones mínimas de esterilidad y que se puede lograr con el uso de un mechero o lámpara de alcohol (zona aséptica).
Una vez seleccionada la proteína fluorescente que convenga, esta se puede ligar al gen de interés y clonarse en un plásmido de expresión bacteriana, es decir, un vector de ADN circular diseñado específicamente para introducir y expresar genes en bacterias.
El siguiente paso es transformar la bacteria, es decir introducir el plásmido de interés.
Materiales
Equipo
Termoblock
Incubadora de agitación
Incubadora convencional
Transiluminador
Lámpara de alcohol o mechero
Reactivos
Células competentes (en este caso usaremos células DH5α).
Instrumentos
Recipiente con hielo
Micropipetas y puntas
Asa de siembra
Tubos de plástico estériles 200 μl (eppendorf)
Tubos de ensayo de vidrio estériles
Gradilla
Procedimiento:
1.Selección de cepa competente.
1.Selección de cepa competente.
Para iniciar se deben seleccionar células competentes (ej. DH5α). Estas células se conservan a -70 °C en un medio de CaCl2 y glicerol.
2 .Mezcla de células competentes con ADN plasmídico.
2 .Mezcla de células competentes con ADN plasmídico.
Se ponen en contacto las células competentes (50-100 μl) y el plásmido (se pueden utilizar concentraciones desde rangos nanomolares) que contiene el gen de interés y/o la proteína fluorescente seleccionada. La incubación se lleva a cabo a 4 °C durante 15 minutos.
3 .Choque térmico.
3 .Choque térmico.
La mezcla que contiene el plásmido de interés y las células competentes se someten a un choque térmico durante dos minutos a 42 °C con el fin de que el plásmido de interés ingrese al citoplasma a través de poros no selectivos de la pared celular de las bacterias. Para recuperarse, se incuba la mezcla sobre hielo durante 15 minutos.
4. Recuperación de la mezcla.
4. Recuperación de la mezcla.
La mezcla se deberá recuperar en 200 μl de medio líquido LB.
5 . Incubación.
5 . Incubación.
Posteriormente se incuba durante 45 minutos en agitación (200 rpm) a 37 °C. Este medio ahora será un cultivo de bacterias con el plásmido que codifica para algún gen de interés y/o la bacteria fluorescente seleccionada.
6. Sembrado del cultivo.
6. Sembrado del cultivo.
Para obtener colonias, se siembran de 20-100 μl del cultivo en una caja Petri con LB sólido el cual contiene un antibiótico de selección correspondiente al plásmido original.
7. Incubación con caja invertida.
7. Incubación con caja invertida.
Las colonias bacterianas crecen después de 12 a 16 horas dentro de una incubadora que mantiene la temperatura a 37 °C
8. Visualización de colonias.
8. Visualización de colonias.
Las colonias bacterianas crecen después de 12 a 16 horas dentro de una incubadora que mantiene la temperatura a 37 °C. Estas se podrán visualizar con un transiluminador.
Resumen Gráfico del Procedimiento
Organismos con Modificaciones Genéticas para Expresar Proteínas Fluorescentes.
Así como se pueden transformar bacterias, introduciendo genes de interés marcados con proteínas fluorescentes, existen ejemplos de otros animales que funcionan como modelos experimentales para experimentos in vivo, como ratones (Mus musculus), peces cebra (Danio rerio) y moscas de la fruta (Drosophila melanogaster) por mencionar algunos. Todos ellos facilitan la investigación en biomedicina, por ejemplo, al dar seguimiento a procesos celulares y moleculares en tiempo real como el desarrollo de tejidos, progresión de enfermedades y tratamientos con ciertos medicamentos, así como estudios de desarrollo en genética y biología del comportamiento.
Referencias:
Bacterial transformation protocol. Consultado el 30 de octubre 2024 en: https://www.addgene.org/protocols/bacterial-transformation/
Protocol: Transformation of DH5a Escherichia coli Bacteria Cells (2019) Peter D Pioli. Consutado el 30 de octubre de 2024 en: https://www.med.wmich.edu/sites/default/files/Pioli_Lab_Cloning_DH5alpha_Cells.pdf
O´Farril, Liset. (2021). Transgénesis: una aproximación a sus riesgos y beneficios. Acta Médica del Centro. 15. 141-155.
Barrientos Bonilla, Abril & Hernandez Baltazar, Daniel & Zavala-Flores, Laura. (2023). Modelos Biológicos en investigación biomédica: características e implicaciones. Contactos, Revista de Educación en Ciencias e Ingeniería, 43.
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