Paso 2. PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)
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La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica esencial en biología molecular que permite amplificar regiones específicas del ADN. Esta técnica fue desarrollada por Kallis Mullis en 1988 y fue diseñada para producir un gran número de fragmentos del material genético, siempre y cuando se conozca parte de la secuencia de ADN que se desea identificar [5].
Una vez identificada la secuencia de nucleótidos que componen al gen de interés, se diseñan los cebadores o primers que permiten el inicio de la síntesis del ADN desde el sitio deseado. Los cebadores son oligonucleótidos compuestos por 15 a 20 bases de ADN, sintetizados químicamente.
Los cebadores permiten el inicio de la síntesis de ADN en direcciones opuestas desde hebras opuestas, por lo cual estos oligonucleótidos son comúnmente llamados cebadores sentido (dirección de la hebra 5’ a 3’) y antisentido (dirección de la hebra 3’ a 5’) [5]. Adicionalmente la síntesis de las nuevas hebras complementarias del ADN se logra a través de la participación de una enzima termoestable llamada ADN Polimerasa, la cual utiliza a los cebadores como punto de partida para iniciar la síntesis de los fragmentos de interés y de esta forma multiplicar el número de moléculas en cada ciclo de amplificación. Estos ciclos de amplificación se realizan con ayuda de un termociclador que establece cambios de temperatura específicos que pueden variar en tiempo de duración y en el número de veces que se repiten (ciclos).
Sucesos más importantes que ocurren dentro un programa de PCR:
Sucesos más importantes que ocurren dentro un programa de PCR:
Desnaturalización del ADN: La mezcla se calienta de 94 a 98 °C para separar las cadenas de ADN.
Alineación: Se enfría la mezcla de 50 a 65 grados centígrados para que los cebadores se unan a las cadenas de ADN.
Extensión: La temperatura se ajusta a 72 grados centígrados para que la Taq polimerasa (ADN polimerasa) sintetice el ADN nuevo.
Imagen 2. Resumen gráfico de los sucesos más importantes del PCR.
Materiales
Materiales
Equipo
Termociclador
Reactivos
Amortiguador 10X
Enzima Taq polimerasa
dNTPS (nucleótidos)
Procedimiento:
Procedimiento:
1 . Mezcla para reacción de amplificación
Una reacción de PCR de 25 µl incluye los siguientes componentes: el templado de ADN extraído; cebadores específicos, también conocidos como oligonucleótidos o primers (sentido y antisentido); nucleótidos libres (dNTPs, del inglés); enzima Taq polimerasa; un amortiguador de la reacción y agua (imagen 1).
Imagen 2. Componentes de la reacción de amplificación.
A continuación se muestra en la tabla 2, un ejemplo de las concentraciones empleadas para una reacción típica de PCR de 25 µl para genotipificar una línea de ratones transgénicos.
2. ADN genómico
Para una reacción de 25 µl se recomienda emplear 5 µl del ADN genómico previamente extraído. El ADN que no se utilice para la reacción puede continuar en almacenamiento a -20°C durante meses, si es necesario.
Consideración: Las cantidades de los componentes para la reacción de amplificación por PCR pueden variar según el protocolo establecido para cada polimerasa.
3. Reacción de amplificación
4. Protocolo de PCR
Se depositan 20 µl de la mezcla en cada tubo de 0.2 ml, junto con 5 µl del ADN extraído de cada muestra.
Colocar los tubos de 0.2 mililitros en el termociclador y establecer el protocolo de PCR que incluya los ciclos térmicos necesarios para favorecer la reacción de amplificación catalizada por la Taq polimerasa. A continuación mostramos un ejemplo de un programa de genotipificación para ratones transgénicos.
Consideración: Las condiciones de reacción para el proceso de amplificación dependen de cada polimerasa, por lo cual cada protocolo de PCR puede tener sus variaciones en la (tabla 3).
Referencias:
5. Coopers George M., & Hausman Robert E. (2014). La célula: un enfoque molecular (6° edición). Marban.
5. Coopers George M., & Hausman Robert E. (2014). La célula: un enfoque molecular (6° edición). Marban.
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