Otimização

Para otimização, usamos o software online Benchling para construir e alterar nossas sequências e plasmídeos; iBioSim para projeto e modelagem de circuitos. Durante a competição, reunimos diferentes partes do Registro iGEM e tentamos implementá-las no modelo de Benchling. Inicialmente, começamos com um único plasmídeo, mas rapidamente decidimos separar nosso circuito principal do kill switch fail safe para diminuir o tamanho do nosso plasmídeo. Dois se tornou três quando percebemos que o último estava ficando muito longo e dividimos o sistema kill switch em dois plasmídeos separados, um contendo as proteínas de fusão responsivas à luz e a nuclease, e um contendo as proteínas necessárias para a síntese do cromóforo que se associa com PhyB. Dito isso, tomamos a decisão de seguir uma abordagem sequencial em vez de simultânea ao transformar os fungos no futuro.

No iBioSim, construímos vários modelos para nosso circuito principal antes de chegar ao nosso projeto final. Poder realizar repetidamente simulações com pequenas alterações entre cada uma nos permitiu identificar quais fatores poderiam ser melhorados em nosso circuito, bem como isolar elementos que não eram perfeitamente compatíveis com nosso sistema. O resultado final é um circuito complexo capaz de degradar compostos tóxicos e fétidos.

Inicialmente, a alta concentração de cobre reprime a atividade de tcu_1 e, consequentemente, permite a expressão de lacase, impedindo a expressão de tetR. Isso fornece um input positivo para a formação do complexo ativo Lacase + cobre (Laccase_Cu), que é capaz de degradar nossos primeiros compostos tóxicos alvo: hidroocarbonos poliaromáticos (PAH) e compostos polifenólicos. A formação de tal complexo acabará resultando em uma diminuição na concentração de cobre do meio, que irá então ativar tcu_1 e promover a expressão de proteínas a jusante (SQR, CysI e tetR). TetR irá ligar tetO2 e impedir a transcrição da lacase (representada pela repressão de miniCMV_Pro), enquanto SQR e CysI irão catalisar a redução de compostos de enxofre.

O objetivo geral é permitir que o fungo concentre sua atividade metabólica na degradação de uma determinada classe de molécula por vez, garantindo que nosso substrato (lixiviado) receba ambas as estratégias de biorremediação de maneira homogênea.

Uma representação visual do nosso modelo cíclico é mostrada abaixo:

Também usamos o Benchling para ajustar as sequências que, de outra forma, não atenderiam aos requisitos da RFC 10, como em BBa_K678045 (que foi registrado como iDLBB_002203 após os ajustes). Além disso, a ferramenta foi utilizada para a remoção de sítios de restrição ilegais em nossas construções e plasmídeos.

A lacase é uma enzima contendo multicobre que catalisa a oxidação de compostos fenólicos (Hoshida et al., 2005). O excesso de cobre reprime a expressão do promotor tcu1 (Lv et al., 2015). Sabendo disso, usamos o software PyMOL para visualizar a estrutura tridimensional da lacase do fungo Trametes versicolor usando uma estrutura que está disponível no site Protein Data Bank (PDB: 1GYC), para obter uma visão de como o cobre interage com a proteína estrutura.