Construção e Testes

Após a análise de nossos resultados de simulação e construções projetadas, acreditamos firmemente que estamos prontos para dar o próximo passo e implementar nosso projeto na etapa de experimentação. Para isso, elaboramos diversos ensaios e experimentos que planejamos realizar durante o desenvolvimento de nosso projeto no próximo ano.

Desenvolvimento de microrganismos

Transformação e expressão

Para a transformação genética em Aspergillus, usaremos marcadores de resistência a medicamentos. No entanto, A. flavus é resistente à higromicina e não pode ser usado para transformação. Em vez de higromicina, os genes de resistência à fleomicina e à piritiamina foram usados para a transformação de A. flavus. Ao contrário das cepas de bactérias ou leveduras, a eficiência de transformação é baixa em fungos filamentosos e, portanto, o processo de transformação é considerado um gargalo na engenharia genética. Além disso, as espécies de Aspergillus contêm uma parede celular rígida, que é o principal obstáculo para aumentar a eficiência da transformação. Atualmente, vários métodos de transformação têm sido desenvolvidos para Aspergillus spp.. E decidimos usar a transformação mediada por polietilenoglicol (PEG), PMT, uma das mais utilizadas.

Transformação mediada por PEG

Este método está bem relatado na literatura e existem métodos e protocolos que podem ser modificados de acordo com a espécie. O procedimento PMT envolve simplesmente cultura de fungos, preparação de protoplastos por meio da degradação da parede celular, entrega de DNA por incubação de PEG, regeneração de transformantes e seleção. Protoplastos são células com as paredes celulares removidas, que são usadas principalmente como células receptoras para PMT.

Tubos germinativos ou micélios jovens são usados ​​principalmente para a transformação de protoplastos de Aspergillus, tratados com várias enzimas de lise da parede celular, como a yatalase, dependentes de espécies de fungos e tipos de células. Após a geração do protoplasto, a solução do protoplasto é misturada com o plasmídeo exógeno sob uma alta concentração de PEG (40–50%) e condição de CaCl2 que induz a captação de DNA e permeabilidade da membrana. Os protoplastos são sensíveis ao estresse osmótico, portanto, durante a preparação e regeneração de estabilizadores osmóticos de protoplastos, como cloreto de potássio e sorbitol, eles devem ser adicionados à solução tampão e ao meio seletivo.

No geral, a PMT é amplamente usada com muitos fungos filamentosos porque não requer equipamentos caros e o procedimento da PMT é simples. No entanto, para alcançar o sucesso na transformação, as condições de cultura, a composição do tampão e as enzimas de degradação da parede celular devem ser otimizadas para cada espécie.

PCR

Para garantir que o plasmídeo foi incorporado, faremos uma triagem de colônias, por meio de PCR. Terá de preparar uma mistura principal de PCR e uma alíquota em tubos de PCR. As colônias são então transferidas das placas de transformação para os tubos.

Em seguida, ocorre a desnaturação e lise celular e liberação dos plasmídeos, que servirão de molde para a PCR. Os primers específicos da inserção confirmarão a presença, bem como o tamanho da inserção. Os produtos de PCR são então executados em um gel de agarose para confirmar a presença ou ausência do gene de interesse. A confirmação da inserção / deleção correta de fragmentos de DNA após a transformação será realizada conforme descrito no protocolo de PCR de tecido pela equipe DTU-Denmark da Competição iGEM 2020.

Purificação

Para a purificação da enzima, pretendemos usar a cromatografia de exclusão por tamanho (SEC), que separa as proteínas com base no tamanho, com os maiores solutos passando por ela com maior velocidade. Ou por CLAE, Cromatografia Líquida de Alta Performance, método de separação de compostos químicos em solução, que é utilizado em química analítica para identificar e quantificar cada componente de uma mistura.

Amostragem de chorume

A amostragem do chorume será realizada seguindo todos os parâmetros de segurança e padrões sanitários aplicáveis ao aterro de Brasília. Temos pessoal treinado para realizar esta tarefa, tendo em vista que o ex-integrante da equipe João Gabriell, já fez a coleta no Rio Melchior, mencionado anteriormente sobre o descarte de chorume tratado no local, por ser membro da Empresa Jr. de Biotecnologia da Universidade de Brasília.

A empresa Genesys Biotecnologia realiza análises de qualidade da água, verificando potabilidade, análises microbiológicas - Visam identificar resíduos orgânicos e microrganismos que podem ser nocivos à saúde, causando doenças ou mal-estar, Cloro, Índice de PH e Parâmetros Físico-químicos. Em breve poderemos realizar uma parceria ou treinamento adequado para esta etapa do processo.

Cultivo de microorganismos

Para promover o crescimento de fungos, as condições de tratamento como temperatura, pH, mistura, etc., são muito importantes. Alguns estudos foram realizados para compreender as condições ideais de tratamento. Estudos têm demonstrado que manter a temperatura do chorume entre 25-33 ° C, pH 4-5, é necessário para atingir o resultado desejado do tratamento. Mistura e aeração adequadas são outros fatores que precisam ser considerados. Também é necessário testar a toxicidade do lixiviado, pois o chorume bruto pode conter alguns compostos tóxicos que são prejudiciais ao crescimento de fungos.

Avaliação do potencial de biorremediação

Para relatar os resultados da biorremediação, avaliaremos a redução de COD e BOD5 por meio de procedimentos padrão, bem como analisaremos as variações das concentrações de polifenóis e compostos de enxofre, uma vez que tais substâncias podem ser degradadas pelas lacases.

Atividade enzimática

Pretendemos determinar os parâmetros cinéticos de enzimas por meio de vários ensaios. Esperamos que a degradação do substrato seja medida espectroscopicamente e também podemos realizar testes usando um substrato modelo, como ABTS, que é um método estabelecido para avaliar oxidorredutases. E isso também é conveniente para medição espectroscópica porque o produto oxidado de ABTS, ABTSox, exibe uma cor azul e é fortemente absorvido em 420 nm.

Avaliação da geração de eletricidade

Na avaliação dos resultados da geração de eletricidade, os parâmetros do sistema e os parâmetros medidos devem ser considerados. A área de superfície dos eletrodos e da membrana, o volume do reator, o tempo de retenção hidráulica e a distância entre os eletrodos são todos parâmetros do sistema que devem ser observados para compreender os resultados. Alguns dos parâmetros medidos serão os potenciais de cátodo e ânodo, voltagem da célula, potencial de circuito aberto, corrente de estado estacionário, resistências internas e externas e duração total do experimento.

Com esses valores em mãos, usaremos a planilha do material suplementar do artigo "A logical data representation framework for electricity-driven bioproduction processes" para calcular nossos resultados. Alguns valores importantes a serem relatados são a densidade de corrente, densidade de potência e eficiência coulômbica.

Testes de Ecotoxicidade

Os objetivos dos testes de ecotoxicidade baseiam-se na preocupação com o destino final do esterco tratado, após conversas com especialistas como Elson Calazans. Para avaliar a eficácia in vivo da biorremediação, procuramos realizar um Ensaio de Toxicidade Aguda com Danio rerio, para determinar a dose sem efeito. No qual será testada a influência do lixiviado antes e após o tratamento para identificar a redução de compostos tóxicos. Bem como testes de fitotoxicidade em espécies modelo para avaliar o impacto do lixiviado na vida terrestre.

Imobilização de células fúngicas

Geralmente, os materiais de suporte são importantes para a produção e estabilidade no chorume, portanto, materiais inertes serão estudados e possivelmente não feitos de plástico para evitar a liberação de outros compostos que impactam negativamente o meio meio ambiente.

Teste do design da MFC

Para fazer a prova de conceito do iUE MFC, a primeira etapa foi refletir sobre quais dos nossos aspectos de design serão mais interessantes para focar no teste. Além disso, todo material que será utilizado na estrutura do MFC será implantado em escala e condições laboratoriais, de acordo com os requisitos para o descarte seguro do chorume, o que inclui a autoclavagem dos materiais. A escolha dos materiais componentes será feita prezando pela utilização de materiais baratos, algumas das peças podem ser feitas em impressora 3D, como as estruturas externas e de suporte para a alocação do nosso substrato.

Para o teste de eficiência de cátodos e ânodos, inocularemos, aclimataremos e enriqueceremos em condições adequadas ao MFC as comunidades de microrganismos nas câmaras, e então avaliaremos seu crescimento. Analisaremos também o pH do substrato, a temperatura, assim como a corrente elétrica gerada pelo G. sulfurreducens, colocando um resistor no circuito entre os eletrodos como a "carga" para sua fonte de alimentação. Porém, as análises mais relevantes serão a remoção de DQO e nitrogênio amoniacal; e a degradação de compostos fenólicos e de enxofre.

Cada lado da câmara terá um volume total de 250 ml, sendo utilizado pano de carbono como ânodo (10 cm x 3 cm) e cátodo (15 cm por 6 cm) em cada câmara. Além disso, é importante manter o lado do cátodo escuro, para evitar a ativação do kill switch do Aspergillus.

• Lamb, T. M., Vickery, J., & Bell-Pedersen, D. (2013). Regulation of gene expression in Neurospora crassa with a copper responsive promoter. G3: Genes, Genomes, Genetics, 3(12), 2273-2280.

• Jönsson, L., Sjöström, K., Häggström, I., & Nyman, P. O. (1995). Characterization of a laccase gene from the white-rot fungus Trametes versicolor and structural features of basidiomycete laccases. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Protein Structure and Molecular Enzymology, 1251(2), 210-215.

• Zhang, C., Meng, X., Wei, X., & Lu, L. (2016). Highly efficient CRISPR mutagenesis by microhomology-mediated end joining in Aspergillus fumigatus. Fungal Genetics and Biology, 86, 47-57.

• Bellí, G., Garí, E., Piedrafita, L., Aldea, M., & Herrero, E. (1998). An activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast. Nucleic acids research, 26(4), 942-947.

• Griesbeck, C., Schütz, M., Schödl, T., Bathe, S., Nausch, L., Mederer, N., ... & Hauska, G. (2002). Mechanism of sulfide-quinone reductase investigated using site-directed mutagenesis and sulfur analysis. Biochemistry, 41(39), 11552-11565.

• Li, D., Tang, Y., Lin, J., & Cai, W. (2017). Methods for genetic transformation of filamentous fungi. Microbial cell factories, 16(1), 1-13.