• 研究動機

研究染色的方法，並觀察微生物染色後的型態

• 實驗原理

利用鑑別染色法來將微生物染色；此方法主要用一種以上的染劑，用來區分細胞的某部位。其中常見的染色法包括：革蘭氏染色法、抗酸性染色法、莢膜染色、胞子染色、鞭毛染色等，本實驗所進行的鑑別染色法為革蘭氏染色法。革蘭氏染色法的原理主要是利用僅存於革蘭氏陽性細菌體的核醣核酸鎂鹽-蛋白質-醣類複合物與染劑間的作用，及陽性菌的細胞壁所含脂質較少的特性，來區別革蘭氏陽性與陰性細胞。

• 實驗方法與步驟

(一)熱固定法

1. 先在乾淨玻片置入無菌水，再以tip輕沾培養基之E.coli菌落，與無菌水混合後用簽字筆標示名字
2. 將玻片上之白色膜狀物，快速在酒精燈上加熱2-3次，以固定菌體

(A) 由液態培養基來的樣品

1. 以接種還沾些許微生物液，置於乾淨玻片上
2. 以畫圈方式將菌液塗抹為一層膜
3. 養品固定：靜置等帶菌液風乾

(B) 由固態培養皿來的樣品

1. 以接種還沾些許無菌水，置於乾淨玻片上
2. 以接種還沾些許微生物菌體，並與無菌水混合，畫圈將菌液塗抹為一層膜
3. 養品固定：將玻片快速過火

(二)染色方法

一、簡單染色

1. 使用熱固定法將E.coli細菌固定於玻片上
2. 使用Crystal violet染劑滴2-3於玻片上，靜置一分鐘
3. 用蒸餾水將多餘的染劑沖掉，注意不要直接沖菌體！
4. 蓋上蓋玻片，使用顯微鏡的100x油鏡觀察菌體

二、負染色

1. 取一滴Nigrosin染劑於在玻片邊緣
2. 使用tip溝一點E.coli菌體制於染劑中混合均於，不用熱固定
3. 使用另一乾淨玻片，將染劑與菌體平推，始樣品由濃漸淡
4. 將蓋玻片覆蓋在較淡處，再使用顯微鏡觀察並拍照

三、革蘭氏染色

1. 將E.coli與B.s熱固定於載玻片上，平放在架子上，先以2%Gram Crystal Violet染劑滴於在玻片的菌體上，作用10秒，再以蒸餾水將多餘染劑沖掉
2. 加入Gram Iodine媒染液，作用10秒，再以蒸餾水將多餘染劑沖掉
3. 再以95%酒精進行脫色作用，作用10秒，再以蒸餾水將多餘染劑沖掉
4. 加入第二種染劑Safranin，作用10秒，再以蒸餾水將多餘染劑沖掉，以拭鏡紙吸去玻片上之水分，於顯微鏡下以100X油鏡觀察

• 實驗心得

這次透過不同的染色法來觀察微生物的型態，學習到每種情形下要使用不同方法，而每種方法的結果都不同，受益良多！其中，操作100X油鏡是我們較為不熟悉的，然而，因為這堂實驗課的學習，也能熟練些了。一開始，無論怎麼移動，視野始終一片灰，還有一堆雜質，可後來慢慢可以快速的調節粗、細調節輪，找到物鏡100X下，細菌的真面目了。