gRNAdesign
CRISPR/Cas9 guide RNA の設計 20170515 aoki
1. KOしたい遺伝子の名前、種名を調べておく
ヒトなら Homo sapiens
マウスなら Mus musculus
ラットなら Rattus norvegicus
犬なら Canis lupus familiaris
2. NCBIのgeneで検索
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene
eg. MMP14 Canis Familiaris だと以下のようなものが出る。いくつか候補がある場合は適当なものを選ぶ
3. ちょっと下がってGenomic regions, transcripts, and productsを見る
4. KOするときは、大体 1st exon を狙うので、1st exonのあたりを拡大する。
* KOするところは別に1st exonでなくても良いと思いますが、私たちは今のところ1st exonを狙っていることが多いです。
** Splicing variantsがいっぱいある場合は共通の exon を狙います。
5. テキストツールで配列を選んで、benchling に保存。大体100 bpくらいあれば十分 gRNA の候補を取ってくることができる。
6. CRISPR/Cas9のgRNAを選ぶ。
* Genomeのところは off target score を検索するときに必要なので、対象とする生き物のゲノムを選ぶこと。
7. 左のチェックボタンを押して(2セット選ぶ)、Assembleを押す
8. Vectorを選んで、Next
例えば、lentiCRISPRv2 や pX459v2 など。
9. 名前は、
lentiCRISPR-dMMP14-1,
lentiCRISPR-dMMP14-2
とかにすると分かりやすい。
保存先のFolderを選ぶ。
新しく名前を付けたプラスミドができる(lentiCRISPR-dMMP14-1とか)。
ここに、自動でプラスミドとFWD、REVのプライマーを設計してくれている(制限酵素のoverhangも考慮して)ので、そのOligo DNAを発注する。
10. qPCRチェック用プライマーの設計
mRNAの配列をNCBI, Geneでとってくる。
Benchilingに登録する。cDNAを取ってくること。
右端のPrimers > Create Primers > Wizard
TaskをqPCR (intercalating Dyes)
Primer
Tm 55 - 60 - 65
Size 20 - 20 - 20
Amplicon
min 200, opt 300, max 500
上のGenerate Primersを押す
Primer resultsが出る。
適当そうなものを選んで右側にEditボタンがある
プライマーをコピペしてPrimer Blastをかける
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome
Organismsを犬ならCanis lupus familiaris (taxid:9615)
待つ
目的のもの以外にもいくつか候補がでるが、相補性が低そうならOK
BenchlingにもどってEditからプライマーに名前を付けてフォルダに保存。
dMMP14-qPCR-F, dMMP14-qPCR-Rとか