gRNAdesign

CRISPR/Cas9 guide RNA の設計 20170515 aoki

1. KOしたい遺伝子の名前、種名を調べておく

ヒトなら Homo sapiens

マウスなら Mus musculus

ラットなら Rattus norvegicus

犬なら Canis lupus familiaris

2. NCBIのgeneで検索

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene

eg. MMP14 Canis Familiaris だと以下のようなものが出る。いくつか候補がある場合は適当なものを選ぶ

3. ちょっと下がってGenomic regions, transcripts, and productsを見る

4. KOするときは、大体 1st exon を狙うので、1st exonのあたりを拡大する。

* KOするところは別に1st exonでなくても良いと思いますが、私たちは今のところ1st exonを狙っていることが多いです。

** Splicing variantsがいっぱいある場合は共通の exon を狙います。

5. テキストツールで配列を選んで、benchling に保存。大体100 bpくらいあれば十分 gRNA の候補を取ってくることができる。

6. CRISPR/Cas9のgRNAを選ぶ。

* Genomeのところは off target score を検索するときに必要なので、対象とする生き物のゲノムを選ぶこと。

7. 左のチェックボタンを押して（２セット選ぶ）、Assembleを押す

8. Vectorを選んで、Next

例えば、lentiCRISPRv2 や pX459v2 など。

9. 名前は、

lentiCRISPR-dMMP14-1,

lentiCRISPR-dMMP14-2

とかにすると分かりやすい。

保存先のFolderを選ぶ。

新しく名前を付けたプラスミドができる（lentiCRISPR-dMMP14-1とか）。

ここに、自動でプラスミドとFWD、REVのプライマーを設計してくれている（制限酵素のoverhangも考慮して）ので、そのOligo DNAを発注する。

10. qPCRチェック用プライマーの設計

mRNAの配列をNCBI, Geneでとってくる。

Benchilingに登録する。cDNAを取ってくること。

右端のPrimers > Create Primers > Wizard

TaskをqPCR (intercalating Dyes)

Primer

Tm 55 - 60 - 65

Size 20 - 20 - 20

Amplicon

min 200, opt 300, max 500

上のGenerate Primersを押す

Primer resultsが出る。

適当そうなものを選んで右側にEditボタンがある

プライマーをコピペしてPrimer Blastをかける

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome

Organismsを犬ならCanis lupus familiaris (taxid:9615)

待つ

目的のもの以外にもいくつか候補がでるが、相補性が低そうならOK

BenchlingにもどってEditからプライマーに名前を付けてフォルダに保存。

dMMP14-qPCR-F, dMMP14-qPCR-Rとか