Oligo DNAのannealingとligation

Oligo DNAのannealingとLigationのプロトコル。

shRNAやgRNAの配列のサブクローニングなどに使えます。

準備 10 x Oligo アニーリングバッファー

100 mM Tris-HCl, pH 8.0

10 mM EDTA, pH 8.0

1 M NaCl

オリゴDNA Forward （乾燥品を注文する）

オリゴDNA Reverse （乾燥品を注文する）

ヒートブロックを95度に温めておく

1 オリゴDNA Forward, Reverse を 200 uM になるようにDDWで溶かす。 よくVortexする。

2 以下の様にエッペンチューブに混ぜる

チューブA

200 uM Oligo F 5ul

200 uM Oligo R 5ul

10x Oligo annealing B 2 ul

DDW 8 ul

Total 20 ul

3 混ぜたエッペンチューブを95度に温めたヒートブロックに入れて4分温める

4 ヒートブロックから外して、スピンダウンする

5 室温で冷えるまで待つ（10分くらい） この液は保存可能

6 このAnnealingしたOligo DNAを 1 x Oligo annealing buffer で 500 倍希釈する。

この液は保存不可能

7 500倍希釈したOligo DNA普通にライゲーションに用いる。Oligoのリン酸化は必要ない（Vectorがself ligationしない場合）。

Insert (annealed oligo DNA) 1.5 uL

Vector 0.5 uL

2x Ligation High ver2 2.0 uL

Total 4.0 uL

16度、30分。

全量、Transformする。

コロニーをピックアップして、制限酵素チェック、シークエンス。

かなりの割合でちゃんとLigationされている。