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Fundamento
El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para el crecimiento de los microorganismos. La composición precisa dependerá de la especie que se quiera cultivar, porque las necesidades nutricionales varían considerablemente. Hay microorganismos muy poco exigentes que crecen bien en medios de laboratorio normales y microorganismos muy exigentes que necesitan determinadas sustancias como vitaminas, suero o sangre para crecer.
Existen medios cuya composición permite el crecimiento de:
1. un gran número de especies (agar nutritivo, caldo ordinario, agar de Sabouraud),
2. determinados microorganismos (impidiendo el desarrollo de otros), son los denominados medios selectivos.
3. Otros en cambio, se desarrollan para el estudio de determinadas pruebas fisiológicas o test bioquímicos (utilización de citratos, acidificación a partir de azúcares, etc.).
Los medios de cultivo poseen una serie de componentes:
1. Indispensables: Entre los primeros se incluye el agua, nutrientes orgánicos (hidratos de carbono, aminoácidos, vitaminas, etc) y nutrientes inorgánicos (P, Fe, N, Mg, S, etc)
2. Alternativos: sustancias isosmotizantes (NaCl), agente solidificante (agar-agar), tampones, indicador de pH, etc.
Durante las prácticas se van a manejar medios de cultivo de composición muy variada y de tres tipos diferentes en cuanto a consistencia: medios sólidos, semisólidos y líquidos. Este último aspecto es importante a la hora de la preparación de los mismos. Aunque los medios artificiales o sintéticos se pueden preparar a partir de sus componentes individuales, se pueden adquirir comercialmente como medios deshidratados a los que solamente hay que añadir la cantidad de agua necesaria. El fabricante indica la composición, la caducidad, y la cantidad que debe pesarse por cada litro a preparar e incluso como debe esterilizarse.
Objetivos concretos de la práctica
1. Preparar medios de cultivo como soporte y fuente de nutrientes para el desarrollo de los microorganismos in vitro.
2. Manejar los instrumentos de uso rutinario, a la vez que imprescindibles, en el laboratorio de microbiología.
3. Hacer un primer acercamiento a la manipulación de microorganismos. Adquirir la idea de la importancia del trabajo en condiciones de esterilidad y las técnicas más comunes para realizarlo.
Realización práctica
Cada mesa de trabajo se encargará de la preparación de una cantidad suficiente de un determinado medio de cultivo, para ser utilizado, en su momento, por todos los alumnos del grupo de prácticas. Las instrucciones a seguir dependerán del número de mesa y el medio de cultivo asignado, pero en todos los casos, los pasos son los siguientes:
1. Disolver los componentes del medio en agua destilada. En muchos casos se parte de un preparado comercial con todos los componentes deshidratados. Siguiendo las instrucciones del fabricante o del profesor, añadir la cantidad de agua adecuada para conseguir la concentración deseada de los mismos. Si el medio contiene un agente solidificante (agar-agar) hay que calentar el preparado hasta la ebullición del mismo agitando de vez en cuando, para asegurar una completa disolución del agar (medios sólidos y semisólidos); para medios líquidos no es necesario calentar, únicamente se agita la mezcla hasta la completa disolución de la misma.
2. Esterilizar la disolución.- Una vez disuelto el medio se debe esterilizar para evitar el crecimiento de contaminantes. Dependiendo de la forma en que vaya a utilizarse el medio, el procedimiento será diferente:
a) Medios sólidos en placa.- Tapar el matraz con tapón de algodón y cubrir con papel de aluminio. Llevar a esterilizar al autoclave (1210C) durante 15-20 minutos. Una vez estéril repartir en placas de Petri estériles y dejar en reposo para que solidifique.
b) Medios sólidos en tubo (agar inclinado)
Tubos de agar inclinado con medio KIA
Tubos de agar inclinado con medio citrato
c) Medios líquidos.- Una vez disueltos los componentes repartir en tubos a razón de unos 2-4 ml por tubo, tapar con tapón de aluminio y llevar a esterilizar en autoclave.
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