Estructura tridimensional de Proteínas

OBJETIVOS

• Obtener y visualizar modelos moleculares tridimensionales de proteínas, utilizando software fácilmente disponible y de libre acceso (open source).

• Utilizar la base de datos de estructuras de proteínas: PDB.

• Reconocer los diferentes niveles estructurales de las proteínas.

METODOLOGÍA

Materiales:

• Base de datos de proteínas: PDB

• Base de datos pictórica de estructuras 3D del PDB: PDB-SUM

• Servidor para reconocimiento de estructuras secundarias de las proteínas: Contact Map WebViewer

• Programa de visualización de estructuras moleculares: Rasmol 2.7.5.2: Descargar

Métodos

I. Análisis de una proteína globular en la Base de datos PDB.

• Ingresar a la página de la base datos PDB

• En la caja de búsqueda escribir el termino identificador : 6BB5 (este termino corresponde a la estructura de la hemoglobina en complejo con una molécula de oxígeno)

• Ir al registro de la estructura buscada, y a la sección "Structure summary"

• Anotar los comentarios que el profesor hace sobre la información registrada para la estructura depositada en la base de datos

• Esta estructura tridimensional es el ejemplo de una proteína formada por varias cadenas polipeptídicas (subunidades). La estructura obtenida por difracción de rayos X incluye las 4 subunidades: alfa₁, alfa₂, beta₁ y beta₂. de la hemoglobina, teniendo el grupo Hemo como grupo prostético y moléculas de oxígeno como ligandos.

• ¿Cuál es la resolución del procedimiento de difracción de rayos X? ¿Qué significa el factor R?

• Ir a la sección "Sequence", podra visualizar la estructura primaria de la proteína, indicando las regiones de secuencia donde se localizan los distintos tipos de estructura secundaria de la proteína.

• Para visualizar la estructura secundaria de la hemoglobina, haremos uso de otro servidor; PDB-SUM. En la caja "PDB code", escribir el código PDB de la estructura de nuestro interés 6BB5, presiones "Find". Ir a la sección "Proteín" y abrir la caja "topology" observar el esquema en 2 dimensiones de la disposición de las estructuras secundarias de la proteína. Esquematizarlas en su reporte de informe.

• Para observar el plot de Ramachandran y determinar si la estructura analizada presenta la mayoria de sus residuos en regiones permitidas para los ángulos diedros φ (phi). ψ (psi) ir a la sección "Top Page" y abrir la caja "PROCHECK". ¿Cuál es la región donde se encuentran la mayoría de aminoácidos?

• Volver a la página de la base de datos PDB. Ir a la sección "3D-View" , a través del visualizador NGL (WebGL based 3D viewer) podrá manipular para su visualización la estructura de la proteína analizada. Observe que la mayoría de la molécula tiene estructura secundaria de hélice alfa y no hay hebras beta. Cada subunidad de globina tiene unido un grupo hemo (una molécula de protoporfirina IX acomplejada con un ion Fe²⁺), responsable del color rojo de la hemoglobina y de la sangre.

• La hemoglobina es una proteína globular, y comparte con otras proteínas de mismo tipo 3 denominadores comunes:

  • Un plegamiento compacto, con poco o ningún espacio para las moléculas de agua.

  • Una localización exterior de casi todos los grupos R hidrófilos.

  • Una localización interna de casi todos los grupos R hidrofóbicos.

• Aunque casi el 70% de la cadena polipeptídica de la hemoglobina se encuentre en forma de hélices alpha, esto constituye una fracción elevada no frecuente. La mayor parte de las proteínas globulares contienen también hojas beta y menos proporción de hélices alpha.

• En el lado derecho de la sección "3D-View", ir a la pestaña "ligand view", seleccionar el grupo hemo: [HEM]201:A. Reconocer todas las interacciones intermoleculares del grupo hemo, la molécula de oxígeno y el/los aminoácidos de la hemoglobina. Esquematizarlo en su reporte de práctica.

• En la caja "Pocket" de la página incrementar el valor de la opacidad "opacity" al 100 %. Observar las dimensiones de los bolsillos o espacios de la proteína donde se encuentra el grupo hemo y la molécula de oxígeno.

• Recuerde que la información que la estructura observada es producto de la interpretación de un mapa de densidad electrónica obtenida luego del procesamiento de la información del patrón de difracción de rayos X. Ir a la sección "Electron density maps". Desplácese en la proteína con click derecho y observar los mapas de densidad electrónica. ¿Para qué átomos observa una mayor densidad electrónica? ¿porqué?. Utilice el nivel 2fo-fc para ello.

• Descargar la estructura de la proteína con código 6BB5, y de modo opcional puede visualizarla usando el programa rasmol.

• Para determinar con precisión las interacciones intramoleculares entre todos los aminoácidos de la proteína estudiada y de modo indirecto los tipos de estructuras secundarias de la proteína se determina los mapas de contacto de los aminoácidos de la proteína. Una sub-unidad de hemoglobina presenta el siguiente mapa de contacto:

• Un programa online para ello se puede acceder a través del servidor Contact Map WebViewer. Escoger la opción "By uploading PDB file" y subir el archivo pdb descargado en el paso anterior. Presionar el botón submit. Obtendrá un mapa de contacto para la proteína, interpretarlo en relación al esquema de estructuras secundarias obtenidas del servidor PDBSUM que usted dibujo en su reporte.

II. Análisis de una proteína fibrosa en la Base de datos PDB.

• • Ahora analizaremos un ejemplo de proteína fibrosa: la Queratina. Para ello procederemos del mismo modo que en el apartado anterior, usando la estructura depositada en la base de datos PDB: 3TNU.

  • Las alpha-queratinas son proteínas insolubles que contienen la mayor parte de aminoácidos corrientes. Entre estas proteínas se encuentran:

    • Las que se encuentran en los cuernos y las uñas que poseen un contenido elevado de enlaces disulfuro (residuos de cistina), hasta un 22 %.

    • Las queratinas más blandas y flexibles de la piel, del pelo y de la lana, que contienen alrededor de 10 a 14 % de cistinas.

  • Para visualizar la estructura emplearemos en la sección "3D-View", otro visualizador de estructuras 3D : JSmol (JavaScript), con este visor podremos observar la unión de las microfibrillas de queratina mediante enlaces disulfuro. Para ello: Click derecho: style --> scheme --> ball and stick

  • Identificar los residuos adyacentes a estos residuos de cisteína, y señalarlos en su reporte. Esquematizar todos los átomos de estos puentes disulfuro.

  • También podremos visualizar claramente las alpha-hélices y los puentes de hidrógeno entre los aminoácidos de las alpha-hélices. Para ello: Click derecho: Style --> hydrogen bonds --> calculate

II. Problemas

1) Para el siguiente mapa de contacto de una proteína problema, Identificar que estructuras secundarias estan presentes en la proteína. Esquematizar la topología de la proteína en base a las estructuras secundarias identificadas.

2. Qué se podría predecir con respecto a la relación de los residuos hidrofilicos con los hidrofóbicos en una serie de proteínas monoméricas globulares con un intervalo de tamaño desde 10 000 hasta 100 000 daltons?

3) La proteína hemaglutinina del virus de la gripe contiene una α-hélice notablemente larga con 53 residuos.

a. ¿Cuál es el largo de la α-hélice (en nm)?

b. ¿Cuántas vueltas tiene esta hélice?

c. Cada residuo en una hélice esta participando en dos enlaces H. ¿Cuántos enlaces H hay en esta hélice?

4) Cuando se lavan las medias o polos de lana en agua caliente o se secan en una secadora eléctrica, encogen ¿Puede dar una explicación a este fenómeno a partir de sus conocimientos sobre la a-queratina? Explíquelo.

5) Examine la estructura de las proteínas (a) y (b) y a continuación señale su diagrama de Ramachandran, correspondiente, argumentando brevemente su elección