OBJETIVOS

• Visualizar de modo crítico y predictivo estructuras de los complejos fármaco-receptor disponibles en bases de datos de acceso libre

• Determinar como los estados de ionización de los residuos de aminoácidos de los fármacos y sus receptores determinan su afinidad de unión.

• Determinar de modo cualitativo que otros factores determinan la unión de los fármacos a sus receptores

• Introducir a los estudiantes el uso de códigos que se usan para automatizar las funciones básicas: “scripting”, del programa rasmol. 

METODOLOGÍA

Materiales: 

• Base de datos de proteínas: PDB

• Porgrama de visualización de estructuras moleculares: Rasmol 2.7.5.2:

• Descargar

Métodos

I. Búsqueda en bases de datos

• Ingresar a la página de la base datos PDB

• En la caja de búsqueda escribir el termino identificador : 6BB5 (este termino corresponde a la estructura de la hemoglobina en complejo con una molécula de oxígeno)

• Ir al registro de la estructura buscada, y a  la sección "Structure summary" 

• Anotar los comentarios que el profesor hace sobre la información registrada para la estructura depositada en la base de datos

• ¿Cuál es la resolución del procedimiento de difracción de rayos X? ¿Qué significa el factor R?

• Ir a la sección "Sequence", podra visualizar la estructura primaria de la proteína, indicando las regiones de secuencia donde se localizan los distintos tipos de estructura secundaria de la proteína.

II. Visualización de un complejo Farmaco-Receptor

• Primero de modo directo mostraremos algunas de las representaciones de la estructura de complejos farmaco receptor:

• Ahora solo visualizaremos los residuos del receptor más proximos a los ligandos en 6 casos, prediciendo de nuestra observación

Ahora usaremos el programa Rasmol en linea de comando para una visualización profesional

1.  Abrir el programa Rasmol, y en la linea de comando usar comando:

zap

2. Descargar la estructura correspondiente a ala ciclooxigenasa en complejo con el fármaco ibuprofeno 4PH9.pdb

La información sobre el nombre de los residuos, ligandos o grupos prosteticos a seleccionar se encuentran en la pagina de donde se descargo el archivo, o en el mismo archivo abriendolo con un editor de texto.

proceder con la siguiente secuencia de comandos

background white

load 4PH9.pdb

Wireframe off

Select all

Cartoon

colour structure

Visualizaras solo las estructuras secundarias de la proteína receptora (enzima)

3.  Proseguir con los siguientes comandos

Select HEM

Wireframe 40

Spacefill 120

colour cpk

Visualizaras adicionalmente a los grupos HEMO de la enzima cicloxigenasa II

4. Proseguir con los siguientes comandos

Select IBP

Wireframe 40

Spacefill 120

colour cpk

Visualizaras la molécula del ibuprofeno en su localización sobre la estructura del receptor

5. Salvar la visualización de la estructura hasta este punto

save script script-4PH9-01.top

6. Proseguir con los siguientes comandos en el que seleccionaremos los residuos que esten proximos al fármaco en un radio de 3.5 Å :

Select within(3.5,IBP) and NOT hetero

Wireframe 40

Spacefill 120

colour cpk

label %n%r

colour label black

7.  Por el momento solo visualizaras los átomos proximos al ibuprofeno, pero  nosotros queremos ver completos los residuos de aminoácidos próximos al ibuprofeno . 

Localizarse visualmente en el farmaco y anotar el nombre de los aminoácidos y su numero.

• • • • • ARG121

        • VAL350

        • TYR356

        • ALA528

        • SER531

8. Conociendo los residuos a seleccionar, y sabiendo que hay dos cadenas A y B (se puede saber abriendo el archivo PDB con un editor de texto o revisando la información en la pagina de donde se descargo el archivo)

select 121,350,356,528,531:A

Wireframe 40

Spacefill 120

colour cpk

label off

9. Repetir el procedimiento para la cadena B

10.  Para diferenciar al farmaco del receptor:

Select IBP

dots 1000 

Visualizaras la molécula del ibuprofeno con sus superficies de van der Walls maracadas por puntos alrededor de la estructura, para diferenciarlas de los residuos aminoácidos del receptor.

11. Salvar la visualización

save script script-4PH9-01.top

Para abrir el script, el comando es:

script script-4PH9-01.top

12. Observar la interacción de los residuos de aminoácidos con el farmaco. Indicar que átomos interactuan y que tipo de interacciones se pueden predecir.

A continuación le presentamos una herramienta desarrollada para la visualización de archivops PDB online:

 PROBLEMAS

1.  A continuación se muestra un esquema de la interaccion de un ligando a la enzima ciclooxigenasa II (COX-2)

Usando la tabla de aminoácidos que esta disponible en la plataforma de la asignatura. Responda las siguientes preguntas sobre la interacción fármaco receptor. 

a) ¿Cuál es el rango de pH en la que la interacción es más eficiente?

b)Indicar el tipo de interacciones moleculares que cada residuo de aminoácido de la enzima COX2 puede establecer con el ligando.

2. A continuación se muestra un esquema de la interaccion de un ligando y su receptor, si el pKa del grupo funcional disociable del ligando es 3.6.

a) ¿Cuál es el pH o rango de pH en la que la energía de interacción sería optima? 

b) Indicar el tipo de interacciones moleculares que cada residuo de aminoácido de la enzima

3. Indique qué interacción fármaco-receptor se muestra en la flecha del diseño del fármaco

4. El siguiente dibujo representa un fármaco y los grupos funcionales circundantes de un sitio activo enzimático. Dibuje líneas que representen cualquier fuerza intermolecular potencial que crea posible entre el fármaco y el sitio activo. Etiquete los tipos de fuerzas intermoleculares potenciales usando uno de los siguientes términos: enlaces H, hidrofóbicos, iónicos, ion-dipolo o interacciones orbitales pi. Explicar por qué

5. Un objetivo potencial para el diseño de fármacos antibióticos en el futuro es la interacción proteína-proteína entre FtsZ y ZipA, proteínas que son fundamentales para la división celular bacteriana. El diseño del fármaco basado en la estructura dio como resultado la identificación del compuesto 1 que se une a ZipA (que se muestra a continuación) y evita la unión de ZipA a  FtsZ. El compuesto mostró una IC50 modesto (1,2 mM) de unión a ZipA y una actividad antibiótica muy débil. 

Si queremos desarrollar un compuesto que se una más estrechamente a ZipA basándonos en la estructura del compuesto 1. proponga al menos dos modificaciones estructurales en el compuesto 1 y explica cómo podrían mejorar la unión de moléculas pequeñas a ZipA.

6. El genoma humano codifica 518 proteínas quinasas diferentes, muchas de las cuales desempeñan funciones importantes en diversos procesos patológicos. Por ejemplo, la proteína quinasa B (PKB) se ha identificado como un objetivo importante contra el cáncer. Sin embargo, la inhibición de proteína quinasas estructuralmente similares, como la proteína quinasa A (PKA), puede provocar efectos secundarios tóxicos. El diseño del fármaco basado en la estructura condujo al diseño de un compuesto (que se muestra a continuación) que tenía selectividad para PKB (IC50 = 6 nM) sobre PKA (1C50 = 168 nM). Los esquemas de las interacciones intermoleculares  importantes entre el farmaco diseñado y las proteínas PKA (izquierda) y PKB (derecha) se muestran a continuación:

a) Dé dos razones por las que el desarrollo de fármacos dirigidos al bolsillo de unión a ATP de PKB podría ser un desafío. b). Dé una justificación estructural para la diferencia en el IC50 del compuesto para PKB frente a PKA.

7. La doxorrubicina (DOX) es un fármaco contra el cáncer que tiene como blanco farmacológico el DNA de las células que se replican rápidamente. a)¿Qué parte del DNA se espera que interactúe con DOX? b). ¿Qué tipo de interacciones tendrá DOX con esta parte del ADN? c)¿Qué tipo de interacción crees que es más importante y por qué? OH NH2 d). Dibuja una esquema de la interacción de DoX con una hebra de ADN. Indique y etiquete claramente la columna vertebral, su direccionalidad, bases y ubicación de DOX.

8. Cada una de las siguientes moléculas viola la reglas de Lipinski por al menos una forma. Indique qué razones se infringen para cada molécula. Explique

9. Determine si los siguientes medicamentos cumplen con las regla de Lipinski. Investigue también los "criterios alternativos" (enlaces rotables, área de superficie polar) para ambos fármacos. 

10.  Compare la capacidad de los átomos de nitrógeno en las siguientes estructuras para actuar como aceptores de enlaces de hidrógeno.

11. La resistencia relativa de los oxígenos de carbonilo como aceptadores de enlaces de hidrógeno se muestra en la figura. Sugerir por qué el orden es como se muestra.

ACTIVIDADES OPCIONALES

1. Usando el programa RASMOL representar la interacción de la cicloxigenasa 2 con las moléculas:

• • Ácido salicilico 1PTH.pdb

  • Ácido araquidónico 3HS5.pdb

Determinar los aminoácidos proximos,, las posibles interacciones intermoleculares y compararlos entre si.

Entregar:

• Un informe de una hoja con alguna imagen y una respuesta a las preguntas.

• El script *.top para reproducir la visualización

Hacer la entrega por el campus virtual de la Facultad