Modelización molecular de fármacos y sus receptores

OBJETIVOS

• Obtener y visualizar modelos moleculares tridimensionales de receptores y sus ligandos, utilizando software fácilmente disponible y de libre acceso (open source).

• Diseñar y optimizar la geometría de moléculas orgánicas usando el programa Avogadro.

• Introducir a los estudiantes el uso de códigos que se usan para automatizar las funciones básicas: “scripting”, del programa rasmol.

METODOLOGÍA

Materiales:

• Base de datos de compuestos químicos: PubChem

• Base de datos de proteínas: PDB

• Programa de edición y visualización de estructuras moleculares: Avogadro 1.2.0

• Descargar

• Porgrama de visualización de estructuras moleculares: Rasmol 2.7.5.2:

• Descargar

Métodos

I. Búsqueda en base de datos PUBCHEM

• Ingresar a la pagina de la base datos PUBCHEM

• En la caja de busqueda escribir el termino identificador (Compound CID ): 441141 (este termino corresponde a la molécula de Vancomicina)

• Buscar en la pagina obtenida el item: Canonical SMILES

• Copiar el formato molecular en una hoja de excel.

• La hoja de excel tiene que tener 14 columnas a ser llenada con la información a localizar en la pagina obtenida :

  • Compound CID

  • Chemical name

  • Common name

  • Molecular Formula

  • Canonical SMILES

  • Molecular Weight

  • XLogP3-AA

  • Hydrogen Bond Donor Count

  • Hydrogen Bond Acceptor Count

  • Rotatable Bond Count

  • Topological Polar Surface Area

  • Complexity

  • ATC Code (1)

  • ATC Code (2)

• Repetir el mismo procedimiento pero introduciendo el nombre de los compuestos

  • Anestesicos locales (grupo I)

    • Lidocain

    • Tetracain

    • Bupivacain

  • Antiinflamatorios no esteroideos (grupo II)

    • Aspirin

    • Ibuprofen

    • Salicylic acid

    • Diclofenac

  • Agonistas adrenérgicos

    • Agonistas α₁ (grupo III)

      • phenylephrine

      • methoxamine

      • alpha-Methylnorepinephrine

      • oxymetazoline

    • Agonistas α₂ (grupo IV)

      • Clonidin

      • Guanfacine

      • Guanabenz

      • Dexmedetomidine

    • Agonista β₁ (grupo V)

      • Dobutamine

      • Isoproterenol

    • Agonista β₂ (grupo V)

      • salbutamol

      • clenbuterol

      • terbutaline

  • Por cada grupo de compuestos luego de almacenar la información en una hoja de excel, comparar sus valores de:

    • • • Molecular Weight

        • XLogP3-AA

        • Hydrogen Bond Donor Count

        • Hydrogen Bond Acceptor Count

        • Rotatable Bond Count

        • Topological Polar Surface Area

  • Discutir los resultados

II. Edición, visualización y optimización de la estructura 3D de moléculas orgánicas

II.1 Dibujar una Molécula organica

• Abrir el programa Avogadro. El programa cuenta con diferentes extensiones (encuéntralas en el menú superior) que le permite al mismo ofrecer al usuario distintas mejoras para sus trabajos. Realmente lo que más destaca de este software es que bastante rápido y eficiente, a diferencia de otros software de este estilo, que en muchas ocasiones colapsan el equipo, y requieren de capacidades técnicas bastante elevadas. En él se pueden construir moléculas, tanto orgánicas como inorgánicas, para posteriormente exportarlas como imagen o trabajar con ellas en el mismo programa.

• La Barras de herramientas en la ventana principal cuenta con:

1. Herramienta de dibujo

2. Herramienta de navegación

3. Herramienta de manipulación del enlace central

4. Herramienta de manipulación

5. Herramienta de selección

6. Rotación automática

7. Optimización automática

8. Medición

9. Alinear moléculas

•Al abrir un archivo en Avogadro, las herramientas de navegacion quedan automaticamente seleccionadas.

• Para comenzar a dibujar descliquea la opcion “Ajustar Hidógeno”. Luego dirije el cursor a la pizarra de dibujo y clickeando el boton izquierdo del mouse dibujas tu elemento.

Si deseas dibujar una molecula manten apretado el boton izquierdo y arrastra que se formara el enlace deseado.

Como ejemplo crea la estructura carbonada de la molecula del propano, y del benceno.

Si quisieras cambiar el tipo de enlace, despliega “Orden de enlace” y elige el enlace deseado.

Luego click izquierdo en el atomo en el que quieres el enlace diferente

• Errores: Si cometes un error puedes usar la opcion “Undo” (deshacer = “Ctrl + Z”) que está dentro de Editar en la barra de navegacion. Tambien puedes borrar atomos o enlaces que has agregado en los ultimos pasos, clickeando sobre ellos con el boton derecho del mouse.

• si deseas eliminar un atomo, coloca el cursor sobre el átomo y un click derecho eliminará el átomo.

• Completar Hidrógenos: Cuando el esqueleto de tu molecula esta armado puedes ir a la opcion “Añadir hidrógenos” que se encuentra en la pestaña “Construir” para agregar los H faltantes.Tambien puedes hacerlo a traves de la opcion “Ajustar Hidrógenos” del menu Configuración de Dibujo, seleccionandola y luego clickeando encima de cada atomo que requiere H.

• Extender la molecula: Simplemente te paras en el hidrógeno y este se transforma en el átomo que desees agregar. Tambien puedes cambiar el numero de enlaces con Orden de enlace y la cantidad de hidrogenos varia automaticamente, repetando la tetravalencia del C.

• Optimizar la Geometría:

• • Primero ir al menu Extensions --> Molecular Mechanics --> Setup Force field

  • Seleccionar el ForceField MMFF94

  • Seleccionar el algoritmo de mimimización de energía: Steepest Descent o Conjugate gradient

  • Luego ir al menu Extensions --> Optimize geometry

  • Otra alternativa es hacer click sobre la herramienta “Optimización Automática” (boton E) o presionar a la vez las teclas “Ctrl + Alt + O”.

  • Con Ctrl + Backspace se borra todo lo hecho en la ventana de edición.

• Moviendo nuestra molecula: Para mover nuestra molecula seleccionamos el boton “herramienta de navegación (F9)” (estrella) en la barra de herramientas.

- Se puede rotar la molecula usando el click izquierdo del mouse.

- Si el click lo hacemos en un espacio vacio la molecula rota alrededor de su centro

- Si deseamos que rote sobre un atomo hacemos click sobre ese atomo.

- Si deseamos centrar nuevamente nuestra molecula, vamos a la barra de navegacion, en la pestaña “Ver” y elegimos la opcion “Centrar”

- Para arrastrar la molecula debemos mantener clickeado el boton derecho del mouse y arrastrar…

- Para acercarla o alejarla (Zoom) utilizo el scroll del mouse (esta accion tiene un cierto retardo).

• Para guardar como imagen: Entrar en “Archivo”, luego “Exportar”, “Gráficos” y seleccionar un formato común de imagen como png., jpeg. O bmp.

II.2 Importar una estructura al programa Avogadro usando el formato SMILES

• Ir a la pagina de la base datos PUBCHEM

• Hacer click en la etiqueta Draw structure y proceder a dibujar la estructura del siguiente compuesto: lynk

• Observar que al terminar de dibujar la estructura organica se genera su formato SMILES en la caja superior de la ventana del programa.

• Copiar el formato molecular en una hoja de excel.

• Ir al programa Avogadro, Menu Build --> Insert --> Smiles

• Aparecera la estructura de la molecula dibujada.

• Proceder a su optimización geométrica

• Salvar las coordenadas de la molécula, Menu File ---> save as... --> Paracetamol.pdb

II.3 Obtener una superficie de Potencial electrostático

• Con la estructura de la anterior etapa del analisis

• Ir al menu extensions --> create surfaces

• Seleccionar

  • • • • • • Surface type: Van der Waals

            • Color by: Electrostatic potential

            • Resolution: medium

            • in display type: Surfaces

• Observar la superficie sobre la estructura, interpretar los resultados

• Para guardar como imagen: Entrar en “Archivo”, luego “Exportar”, “Gráficos” y seleccionar un formato común de imagen como png., jpeg. O bmp.

III. Visualización de complejos Farmaco-Receptor usando RASMOL

1. Para arrancar RasMol en Microsoft Windows, haga doble clic en el icono RasMol del gestor de programas. Cuando RasMol arranca por primera vez el programa muestra una ventana principal única con un fondo negro y además provee de una ventana para la línea de comandos, minimizada, como un icono. La línea de comandos puede ser maximizada.

• Observación: Si instalo el programa en el directorio por defecto C:\Archivos de programa\raswin ( C:\program files\raswin). ir a ese directorio y abrir el ejecutable raswin.exe como administrador. Descargar los archivos PDB en otro directorio (por ejemplo C:\Users\alumno\Downloads) y de alli copiar y pegar como administrador en el directorio C:\Archivos de programa\raswin.

Se puede especificar el nombre de un archivo de coordenadas atómicas o el nombre de un script o ambos en la ventana de línea de comandos. El formato será para un archivo script añadir la opción '- script <nombre-del-archivo>'a la línea de comando.

Un archivo de coordenadas moleculares se especifica escribiendo su nombre en la línea de comandos, opcionalmente precedido por la opción de tipo de formato. Si no se especifica el tipo de archivo, por defecto se asumirá que es PDB. Las opciones válidas son: '-pdb', '-mdl', '-mol2', '-xyz', '- alchemy' o '-charmm', -'mopac' y 'CIF' que se corresponden con los formatos Protein Data Bank, Mol de Molecular Design Limited, Sybyl Mol2 de Tripos, XMOL xyz de MSC, Alchemy de Tripos, CHARMm, MOPAC de J. P. Stewart y CIF o mmCIF de la Unión Internacional de Cristalográfía, respectivamente.

Si simultáneamente se especifican tanto un archivo, como un script en la línea de comandos, la molécula se carga primero y después los comandos del script se aplican a él. Si el archivo no se encuentra, el programa muestra el mensaje de error "Error: File not found!" y ante el usuario recibe el inductor de RasMol.

Controles del ratón

Aquí se presenta un resumen de los controles clica-y-arrastra de ratón de RasMol. El comando set mouse por defecto está ajustado a set mouse rasmol, que proporciona los controles resumidos a continuación. Sin embargo, también existen los modos set mouse insight y set mouse quanta (que no se muestran aquí).

*En algunas computadoras Mac, la opción (Alt) tecla tiene el mismo efecto que el comando "key" de RasMol.

No confundir mayusculas y minusculas, esta linea de comandos es similar a la del entorno linux.

2. A continuación presentamos una lista de los comandos y claves reconocidas actualmente por RasMol

Y también de los terminos predefinidos que se pueden usar en los scripts.

Acidic = Asp, Glu

Acyclic = amino and not cyclic

Aliphatic = Ala, Gly, Ile, Leu, Val

Alpha = alpha carbons (don't confuse with helix)

Amino = all atoms in amino acids

Aromatic = His, Phe, Trp, Tyr

Basic = Arg, His, Lys Buried = amino and not surface

or Ala, Leu, Val, Ile, Phe, Cys, Met, Trp

or (Hydrophobic and not Pro) or Cys

Charged = acidic or basic

Cyclic = amino and (aromatic or Pro)

Hetero = all atoms designated HETATM in the PDB file;

all hetero atoms are classified as either solvent or ligand.

Hydrogen = hydrogen or deuterium,

same as elemno=1

Hydrophobic = Ala, Leu, Val, Ile, Pro, Phe, Met, Trp

Ions = phosphate, sulfate hetero atoms

Large = amino and not (small or medium)

or Leu, Ile, Phe, Met, Trp, Tyr, Glu, Gln, His, Lys, Arg

Ligands = hetero and not solvent

Medium = Val, Thr, Asp, Asn, Pro, Cys

Neutral = amino and not (acidic or basic)

Polar = amino and not hydrophobic

or Cys, Gly, Ser, Thr, Lys, Asp, Asn, Glu, Arg, Gln, Tyr, His

Small = Ala, Gly, Ser

Solvent = water or ions

Surface = amino and not buried

or Gly, Ser, Thr, Lys, Asp, Asn, Glu, Pro, Arg, Gln, Tyr, His

or (polar and not Cys) or Pro

Probar la linea de comandos, cambiando el fondo a color blanco, ¿qué comando usare?

Puedes consultar la funcionalidad de cada comando a través del lynk hacia la pagina oficial del programa

III.1 Visualización 3D de Proteínas

3. Guardar la siguiente structura de una proteína X en el directorio Raswin del programa Rasmol, Visualizar la estructura usando la linea de comandos:

load ProteinX.pdb

4. Quiero destacar en la estructura solo los aminoácidos correspondientes a la histidina y a la serina, y a su vez tener una idea de su movilidad ¿a qué se debería este interés?. Copia los siguientes comandos:

Cartoon

colour temperature

select HIS, SER

Wireframe 40

Spacefill 120

colour cpk

5. Guardar todas las modificaciones que realizaste como un script de rasmol, usando el comando:

save script script-01.top

Cuando quieras abrirlo usa el comando: script script-01.top

6. Deshacer todas las modificaciones con los siguientes comandos:

Wireframe off

Spacefill off

Select all

Cartoon

colour structure

7. Queremos localizar todos los aminoacidos hidrofóbicos

select hydrophobic

Wireframe 40

Spacefill 120

colour cpk

Guarda esta visualización como script-02.top.

Localiza ahora los aminoácidos polares y dales coloración azul a sus átomos, guarda los resultados también.

8. Usa los siguientes comandos de modo secuencial

Cartoon

colour structure

Wireframe off

select Mg

Spacefill

colour green

Select within(2.6,Mg)

Wireframe 40

Spacefill 120

colour cpk

label %n%r

colour label black

select HOH173, SER17, GCP167, HOH172, THR35

select Mg

dots 1000

set picking distance

save script script-04.top

¿Como se llama el ligando unido a esta proteína?

¿Porqué no visualizo los átomos de hidrógeno?

III.2 Visualización de un complejo Farmaco-Receptor

9. Ir al menu archivo --> cerrar los trabajos anteriores, o directamente en la linea de comando usar:

zap

10. Descargar la estructura correspondiente a ala ciclooxigenasa en complejo con el fármaco ibuprofeno 4PH9.pdb

La información sobre el nombre de los residuos, ligandos o grupos prosteticos a seleccionar se encuentran en la pagina de donde se descargo el archivo, o en el mismo archivo abriendolo con un editor de texto.

proceder con la siguiente secuencia de comandos

background white

load 4PH9.pdb

Wireframe off

Select all

Cartoon

colour structure

Visualizaras solo las estructuras secundarias de la proteína receptora (enzima)

11. Proseguir con los siguientes comandos

Select HEM

Wireframe 40

Spacefill 120

colour cpk

Visualizaras adicionalmente a los grupos HEMO de la enzima cicloxigenasa II

12. Proseguir con los siguientes comandos

Select IBP

Wireframe 40

Spacefill 120

colour cpk

Visualizaras la molécula del ibuprofeno en su localización sobre la estructura del receptor

13. Salvar la visualización de la estructura hasta este punto

save script script-4PH9-01.top

14. Proseguir con los siguientes comandos en el que seleccionaremos los residuos que esten proximos al fármaco en un radio de 3.5 Å :

Select within(3.5,IBP) and NOT hetero

Wireframe 40

Spacefill 120

colour cpk

label %n%r

colour label black

15. Por el momento solo visualizaras los átomos proximos al ibuprofeno, pero nosotros queremos ver completos los residuos de aminoácidos próximos al ibuprofeno .

Localizarse visualmente en el farmaco y anotar el nombre de los aminoácidos y su numero.

• • • • • ARG121

        • VAL350

        • TYR356

        • ALA528

        • SER531

16. Conociendo los residuos a seleccionar, y sabiendo que hay dos cadenas A y B (se puede saber abriendo el archivo PDB con un editor de texto o revisando la información en la pagina de donde se descargo el archivo)

select 121,350,356,528,531:A

Wireframe 40

Spacefill 120

colour cpk

label off

16. Repetir el procedimiento para la cadena B

17. Para diferenciar al farmaco del receptor:

Select IBP

dots 1000

Visualizaras la molécula del ibuprofeno con sus superficies de van der Walls maracadas por puntos alrededor de la estructura, para diferenciarlas de los residuos aminoácidos del receptor.

18. Salvar la visualización

save script script-4PH9-01.top

Para abrir el script, el comando es:

script script-4PH9-01.top

19. Observar la interacción de los residuos de aminoácidos con el farmaco. Indicar que átomos interactuan y que tipo de interacciones se pueden predecir.

IV. PROBLEMAS

1. Dada las siguientes coordenadas para el ácido acetilsalicílico, ¿Cuáles serán sus coordenadas si desplazamos la molécula 10 A en la dirección del eje Y.

2. Del anterior ejercicio, a) ¿Cuál es la distancia de enlace entre el átomo 1 y 15? b) ¿Cuál es el ángulo formado por los átomos 4, 2 y 5? c) ¿Cuál es el ángulo diedro formado por los átomos 5, 4, 6 y 10?

3. Del anterior ejercicio. ¿Cuál es la energía de enlace entre el átomo 7 y 18, de acuerdo al termino de enlace del campo de fuerza:

Si: K_r(C-Ar-H) = 55.5 Kcal mol^-1/Ų y r_eq = 1.084 Å

4. La hormona adrenalina interactúa con las proteínas ubicadas en la superficie de las células y no atraviesa la membrana celular. Sin embargo, las moléculas esteroideas más grandes, como la estrona, cruzan las membranas de las células e interactúan con las proteínas ubicadas en el núcleo celular. ¿Por qué una molécula esteroide grande puede atravesar la membrana celular cuando una molécula más pequeña como la adrenalina no puede?

5. Queremos optimizar el siguiente sistema molecular usando el campo de fuerza MMFF94. ¿Como plantearíamos la función de energía a minimizar?

E_MMFF = ΣEB_ij + ΣEA_ijk + ΣBA_ijk + ΣEOOP_ijk;l + ΣET_ijkl +ΣEvdW_ij + ΣEQ_ij

6. Considere las estructuras de los neurotransmisores mostrados en la figura y sugiera qué tipo de interacciones de unión podrían estar involucradas en su unión a un sitio de unión del receptor. Señale los posibles aminoácidos en el sitio de unión que podrían participar en cada una de estas interacciones de unión.

7. Usando el campo de fuerza MMFF94, queremos determinar la energía de interacción entre las dos moléculas del siguiente sistema. ¿Como plantearíamos la función de energía de interacción para este sistema?

E_MMFF = ΣEB_ij + ΣEA_ijk + ΣBA_ijk + ΣEOOP_ijk;l + ΣET_ijkl +ΣEvdW_ij + ΣEQ_ij

8. La resistencia relativa de los oxígenos de carbonilo como aceptadores de enlaces de hidrógeno se muestra en la figura. Sugerir por qué el orden es como se muestra.

9. Compare la capacidad de los átomos de nitrógeno en las siguientes estructuras para actuar como aceptores de enlaces de hidrógeno.

10. Los siguientes son datos obtenidos en la base de datos PubChem para los fármacos antihipertensivos: Reserpine y Rescinnamine

a) Determinar el porcentaje de estos fármacos que podrían ser absorbidos en el estómago (pH~2), intestino (pH~6.5) y en el colon (pH~8) b)¿Qué propiedades farmacocinéticas y farmacodinamicas, Usted considera diferencian estos dos compuestos? Fundamente

11. Los siguientes son datos obtenidos en la base de datos PubChem para los fármacos antiinflamatorios no esteroideos:

a) Determinar el porcentaje de estos fármacos que podrían ser absorbidos en el estómago (pH~2), intestino (pH~6.5) y en el colon (pH~8). b) A continuación mostramos un esquema del sitio de unión de estos fármacos a la enzima ciclooxigenasa I

Indicar cuál de los fármacos planteados llegara más rápido al sitio de acción (Ej: tejido muscular) y cuál tendría una mayor fuerza de unión a la enzima. Basar su respuesta en los datos mostrados en la tabla y el esquema del sitio de unión a la enzima.

12. Los siguientes son datos obtenidos en la base de datos PubChem para los fármacos Agonistas adrenérgicos α1:

a) Completar la tabla. b) Determinar el porcentaje de estos fármacos que podrían ser absorbidos en el estómago (pH~2), intestino (pH~6.5) y en el colon (pH~8). c) Basados en los datos mostrados ¿Cuál de estos fármacos con mayor probabilidad se almacenarían en tejido graso?

13. A continuación se muestra un esquema de la interaccion de un ligando a la enzima ciclooxigenasa II (COX-2)

Indicar el tipo de interacciones moleculares que cada residuo de aminoácido de la enzima COX2 puede establecer con el ligando.

14. A continuación se muestra un esquema de la interaccion de un ligando y su receptor, si el pKa del grupo funcional disociable del ligando es 3.6.

¿Cuál es el pH o rango de pH en la que la energía de interacción sería optima?

V. ACTIVIDADES OPCIONALES

1. Usando el programa RASMOL representar la interacción de la cicloxigenasa 2 con las moléculas:

• • Ácido salicilico 1PTH.pdb

  • Ácido araquidónico 3HS5.pdb

Determinar los aminoácidos proximos,, las posibles interacciones intermoleculares y compararlos entre si.

Entregar:

• Un informe de una hoja con alguna imagen y una respuesta a las preguntas.

• El script *.top para reproducir la visualización

Hacer la entrega por el campus virtual de la Facultad