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摘要
摘要
繼細菌培養之後，我們要如何對微生物進行實驗呢？微生物如此細小，我們要如何觀察它們呢？於是來到這次課程的重點——細菌染色，大多數細胞通常是透明無色的，細菌也不例外，所以唯有透過染色，我們才能順利觀察。今天，我們將實際操作單染法（simple staining）、負染色（Negative staining）以及醫學上常用的分類染色：革蘭氏染色法（Gram's stain）。
實作方法與結果
實作方法與結果
單染法（Simple staining）
單染法（Simple staining）
- 用熱固定法將E. coli固定在載玻片上，並滴上Crystal violet染劑，靜置60秒。
- 在染槽上用洗滌瓶洗去多於染劑。蓋上蓋玻片，使用100X的油鏡觀察。
▲ simple-stained E. coli
負染法（Negative stainnig）
負染法（Negative stainnig）
- 取一滴苯胺黑（Nigrosin）於載玻片邊緣，並使用滅菌接種環將E. coli 均勻混於染劑中。
- 取另一載玻片，將染劑與菌體混合液平推，使樣品由濃漸淡。
- 取蓋玻片於較淡處，使用100X油鏡觀察。
▲照片中的碎屑狀物體為雜質，而較小的白色桿狀物體即為E. coli。左圖染劑有點過多了。
E. coli （Gram negative）
LP33（posess both pos./neg.）
LP33 + B. s
B. s（Gram positive )
LP33 + E. coli
革蘭氏染色（Gram's stain）
革蘭氏染色（Gram's stain）
原理簡述：
- 將樣品熱固定後進行染色。革蘭氏染色法由四種藥劑組成：結晶紫（初染劑）、碘液（媒染劑）、95%乙醇（脫色劑）和番紅（複染劑）。
- 在革蘭氏陽性菌中的核糖核酸鎂鹽-蛋白質-醣複合物（Mg RNA-protein-carbonhydrate complex）會與結晶紫和碘液形成複合物（CV-I），為酒精無法溶解的物質；又就革蘭氏陽性菌而言，其細胞壁具有較厚的肽聚醣及較少脂質，染色步驟中以酒精處理時，細胞壁形成脫水使滲透壓降低，CV-I於是無法溶出，形成紫色。
- 而革蘭氏陰性菌的細胞壁富含脂蛋白（lipoprotein）和脂多醣（lipopolysaccharide），且細胞壁肽聚醣層較薄，使用乙醇處理時，細胞壁的脂質溶解，孔隙變大，CV-I則可以輕易溶出。在染色步驟的最後加入Safranin將革蘭氏陰性菌染上淡紅色。
問題討論
問題討論
1. 請問細菌細胞壁結構如何影響革蘭氏染色的結果？
1. 請問細菌細胞壁結構如何影響革蘭氏染色的結果？
革蘭氏染色法中，結晶紫-碘複合物是否能不被酒精脫色的關鍵在於細菌細胞壁的結構。
革蘭氏陽性菌的細胞壁（如下圖）具有較厚的肽聚醣層，並具有較少的脂質能被酒精溶解，當乙醇脫色處理時，細胞壁呈脫水狀態，低滲透壓的結果就是CV-I 無法溶出，形成紫色。
而革蘭氏陰性菌的細胞壁擁有較薄的肽聚醣以及豐富的脂多醣，在脫色時能被乙醇溶解，細胞壁通透性增加，於是CV-I 溶出，菌體變回無色透明的狀態。
2. 請問革蘭氏染色實驗中，最重要的步驟是什麼？
2. 請問革蘭氏染色實驗中，最重要的步驟是什麼？
應為乙醇脫色。
分別出革蘭氏陰性或陽性的關鍵在於其能否被CV-I 所染色，而脫色後就能將兩者分別。
脫色後加入Safranin的染色並非決定性的步驟，僅是讓革蘭氏陰性菌顯色而已。
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