Microdilución EUCAST

Descripción breve de la técnica

La técnica de microdilución diseñada por el EUCAST es similar a la técnica de microdilución del CLSI, aunque presenta algunas modificaciones entre las que destacan las siguientes:

• Tipo de placa: mientras que la técnica del CLSI utiliza microplacas con pocillos de fondo en forma de U, la técnica del EUCAST utiliza microplacas con pocillos de fondo plano.

• Contenido en glucosa del medio de cultivo (RPMI 1640), que es del 0,2% p/v en la técnica del CLSI y del 2% p/v (20 g/L) en la técnica del EUCAST, lo cual favorece un crecimiento más rápido de los hongos.

• Concentración final de inóculo, que es mayor en el EUCAST que en el CLSI, lo que facilita una lectura más rápida de los resultados (tiempos de incubación más cortos). Además, en la técnica del EUCAST la suspensión de trabajo de células de levadura o esporas de hongos filamentosos utilizada como inóculo de las placas del ensayo es realizada en agua destilada estéril, en lugar de en medio RPMI 1640 como en la técnica del CLSI.

• Determinación de los resultados, que se realiza preferentemente por espectrofotometría en el caso de la técnica EUCAST, frente a la determinación puramente visual de la técnica CLSI.

A nivel experimental, la técnica de microdilución según el estándar EUCAST consta de los siguientes pasos:

1) Preparación de las placas del ensayo. Se preparan soluciones de trabajo (que consisten en diluciones dobles seriadas) de los agentes antimicóticos a analizar, las cuales se añaden a las microplacas del ensayo en volúmenes de 100 μL por pocillo. Las diluciones dobles seriadas del antifúngico se preparan en RPMI 1640 + 2% glucosa al doble de concentración (2×), para permitir una dilución al 50% (1:1) tras añadir el inóculo fúngico, y se dispensan en los pocillos de placas de microdilución desechables de plástico estéril con fondo plano. Concretamente, en los pocillos de las columnas 1 a 10 de la placa de microdilución se ponen 100 μL de la dilución correspondiente del agente antifúngico (de mayor a menor concentración), mientras que en cada pocillo de las columnas 11 y 12 se ponen 100 μL de medio de cultivo sin antifúngico. Una vez preparadas, las placas del ensayo pueden introducirse en bolsas de plástico o envolverse en papel de aluminio para su almacenamiento en el congelador, a -70 ⁰C durante un máximo de 6 meses o a -20 ⁰C durante menos de 1 mes; en el caso de las equinocandinas, que presentan mayor inestabilidad, las placas deben guardarse siempre a al menos -70ºC y ser utilizadas antes de 2 meses.

2) Preparación del inóculo. En el caso de las levaduras, se parte de un cultivo fresco a partir de la cual se prepara una suspensión de células en agua destilada estéril. En general, la concentración de células en dicha suspensión debe estar en torno a 1-5 × 106 unidades formadoras de colonias (UFC) por mililitro, lo que equivale a un patrón McFarland de 0,5 ó 1, según la especie fúngica analizada. Por su parte, en el caso de los hongos filamentosos, normalmente se recomienda cubrir las colonias con aproximadamente 5 mL de agua destilada estéril suplementada con Tween 20 al 0,1% v/v para favorecer la separación de las esporas y facilitar su posterior conteo. Además, en el caso de que la suspensión de esporas resultante contenga un número significativo de fragmentos de hifas (>5% de estructuras fúngicas), se recomienda filtrar dicha suspensión a través de un filtro estéril con diámetro de poro de 11 μm. Posteriormente, se ajusta la concentración de esporas a un valor de entre 2 y 5 × 106 esporas/mL con la ayuda de una cámara de hemocitómetro. Alternativamente, se puede ajustar la concentración de las suspensiones de células de levadura o de esporas de hongos filamentosos a una turbidez equivalente al patrón McFarland 0,5 mediante un espectrofotómetro. Finalmente, tanto en el caso de levaduras como de hongos filamentosos, se prepara una dilución 1/10 de la suspensión inicial para obtener la suspensión de trabajo (1-5 × 105 UFC/mL para levaduras y 2-5 × 105 esporas/mL para hongos filamentosos).

3) Inoculación e incubación de las placas. El día del ensayo, se procede a descongelar las placas de microdilución preparadas en el paso 1. Dichas placas, que contienen las diluciones seriadas del antifúngico deseado, se deben inocular dentro de los 30 minutos posteriores a la preparación de las suspensiones de levaduras y/o esporas, para así evitar la pérdida de viabilidad de los aislamientos fúngicos. Generalmente, cada fila de la placa se utiliza para analizar la sensibilidad antifúngica de un aislamiento diferente, pudiéndose por tanto analizar hasta 8 aislamientos por placa. Así pues, cada pocillo de una de las filas de la placa de microdilución se inocula en las columnas 1 a 10 con 100 μL de una de las suspensiones de trabajo preparadas en el paso anterior, intentando no tocar con las puntas de pipeta el contenido del pocillo. Por otro lado, el pocillo de la columna 11, que no contiene antifúngico alguno, se inocula también con 100 μL de la misma suspensión para actuar como control de crecimiento. Por el contrario, en el pocillo de la columna 12 de cada fila de la placa de microdilución, que tampoco contiene antifúngico alguno, se añaden 100 μL del agua destilada estéril utilizada para preparar el inóculo; este pocillo de la columna 12 actuará como control de esterilidad. Finalmente, se pone a incubar las placas del ensayo sin agitación y a la temperatura y tiempo adecuado (generalmente 35ºC durante 24-48 h).

4) Lectura e interpretación de los resultados. En la técnica EUCAST, la determinación de los resultados debe hacerse preferiblemente (sobre todo en el caso de levaduras y de Aspergillus fumigatus) por espectrofotometría, introduciendo las placas de microdilución en un lector de placas y realizando la medida de las absorbancias a una longitud de onda de 530 nm (o, alternativamente, a 405 nm ó 450 nm). En estos casos, el valor del blanco debe restarse de las lecturas del resto de pocillos y una absorbancia igual o inferior a 0,2 indica un crecimiento deficiente de hongo y la necesidad de seguir incubando el ensayo durante otras 12 a 24 h. Por el contrario, debido a la falta de datos, no se recomienda la lectura espectrofotométrica de los resultados para otras especies de hongos filamentosos diferentes a A. fumigatus, siendo necesario en estos casos realizar una lectura visual.

En cuanto a la determinación de los valores de CMI para levaduras, la CMI de anfotericina B es la concentración más baja del compuesto que da lugar a una inhibición del crecimiento (reducción de la densidad óptica) de ≥90% respecto al control sin antifúngico. Por su parte, la CMI de flucitosina (5-fluorocitosina), azoles y equinocandinas para levaduras es la concentración más baja que da lugar a una inhibición del crecimiento de al menos el 50% respecto al control sin antifúngico. En el caso de los hongos filamentosos, la CMI para anfotericina B y azoles se define como la concentración más baja del compuesto que da lugar a una reducción de la densidad óptica de ≥90% respecto al control sin antifúngico (lectura espectrofotométrica) o que no produce un crecimiento visible (lectura visual). Finalmente, la concentración mínima efectiva (CME) de las equinocandinas frente a Aspergillus spp. y otras especies de hongos filamentosos se define como la concentración más baja del compuesto en la que se observan grupos de microcolonias, formados por hifas anormales (muy ramificadas y en forma de roseta) en contraste con el crecimiento miceliar (hifas largas y no ramificadas) del pocillo de control de crecimiento.

5) Controles de calidad y esterilidad. La técnica del EUCAST establece sistemas de control de calidad y esterilidad similares a los de la técnica de microdilución del CSLI para garantizar la fiabilidad del ensayo.