Microdilución CLSI
Descripción breve de la técnica
La dilución en caldo es una de las metodologías más utilizadas para determinar la actividad in vitro de los fármacos antifúngicos. En términos generales, esta técnica utiliza una serie de tubos de ensayo (macrodilución) o una placa de microtitulación (microdilución) que contiene un medio de cultivo estándar, diluciones en serie de un antifúngico y una cantidad predeterminada de inóculo del hongo a analizar. Si bien la macrodilución fue el método original, la microdilución o dilución en placas de microtitulación es la modalidad de uso más generalizado hoy día. La técnica de microdilución en caldo establecida por el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) es, junto a la técnica de microdilución establecida por el EUCAST, uno de los dos estándares más aceptados a nivel internacional para la realización de antifungigramas.
La técnica de microdilución del CLSI, descrita en los documentos M27 y M38 para levaduras y hongos filamentosos, respectivamente, utiliza placas de poliestireno sin tratar en la que los pocillos tienen un fondo en forma de U. El medio de cultivo utilizado en el ensayo es el RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 con L-glutamina y rojo fenol como indicador de pH pero sin bicarbonato, tamponado a un pH 7 con ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS) y con una concentración de glucosa del 0,2 %.
La realización de la técnica consta de las siguientes operaciones:
1) Preparación de las placas del ensayo. Se preparan soluciones de trabajo (que consisten en diluciones dobles seriadas) de los agentes antimicóticos a analizar, las cuales se añaden a las microplacas del ensayo en volúmenes de 100 μL por pocillo. Las diluciones dobles seriadas del antifúngico se preparan en RPMI 1640, y se dispensan con la ayuda de una pipeta multicanal en los pocillos de placas de microdilución desechables de plástico estéril. En los pocillos de las columnas 1 a 10 de la placa de microdilución se ponen 100 μL de la dilución correspondiente del agente antifúngico (de mayor a menor concentración), mientras que en cada pocillo de las columnas 11 y 12 se ponen 100 μL de medio de cultivo sin antifúngico. Una vez preparadas, las placas del ensayo pueden almacenarse a -70 ⁰C durante un máximo de 6 meses o a -20 ⁰C durante menos de 1 mes; en el caso de las equinocandinas, que presentan mayor inestabilidad, las placas deben guardarse siempre a al menos -70ºC y ser utilizadas antes de 2 meses.
2) Preparación del inóculo. En el caso de las levaduras, se parte de un cultivo fresco del aislamiento a analizar, a partir del cual se prepara una suspensión de células en solución salina (0,85% NaCl, p/v). En general, la concentración de dicha suspesión debe estar en torno a 1-5 × 106 unidades formadoras de colonias (UFC) por mililitro, lo que equivale a un patrón McFarland de 0,5 ó 1, según la especie analizada. La suspensión de trabajo se prepara realizando una dilución 1:50 de la suspensión inicial, seguida de otra dilución 1:20 en medio RPMI 1640 para obtener una concentración de 1-5 × 103 UFC/mL. Por su parte, el protocolo para hongos es similar, pero la solución salina utilizada para preparar el inóculo suele contener Tween 20 (p.ej., al 0,1% v/v) para favorecer la separación de las esporas y se hace una dilución 1:50 de la suspensión inicial para que la suspensión de trabajo tenga una concentración de 0,4-5 × 104 esporas/mL para hongos no dermatofitos y de 1-3 × 104 esporas para dermatofitos. Además, si la concentración de esporas se ajusta por espectrofotometría, el valor de absorbancia que se debe alcanzar depende en gran medida de la especie fúngica analizada, debido a la gran diferencia de tamaño existente entre las esporas de los hongos filamentosos.
3) Inoculación e incubación de las placas. El día del ensayo, se procede a descongelar las placas de microdilución preparadas en el paso 1. Dichas placas, que contienen las diluciones seriadas del antifúngico deseado, se deben inocular dentro de los 30 minutos posteriores a la preparación de las suspensiones de levaduras y/o esporas, para así evitar la pérdida de viabilidad de los aislamientos fúngicos. Generalmente, cada fila de la placa se utiliza para analizar la sensibilidad antifúngica de un aislamiento diferente, pudiéndose por tanto analizar hasta 8 aislamientos por placa. Así pues, cada pocillo de una de las filas de la placa de microdilución se inocula en las columnas 1 a 10 con 100 μL de una de las suspensiones de trabajo preparadas en el paso anterior (es decir, se realiza una dilución 1:2 del inóculo), intentando no tocar con las puntas de pipeta el contenido del pocillo. Por otro lado, el pocillo de la columna 11, que no contiene antifúngico alguno, se inocula también con 100 μL de la misma suspensión para actuar como control de crecimiento. Por el contrario, en el pocillo de la columna 12 de cada fila de la placa de microdilución, que tampoco contiene antifúngico alguno, se añaden 100 μL del agua destilada estéril utilizada para preparar el inóculo; este pocillo de la columna 12 actuará como control de esterilidad. Finalmente, se pone a incubar las placas del ensayo a microdilución sin agitación a la temperatura y tiempo adecuado (generalmente 35ºC durante 24-48 h).
4) Lectura e interpretación de los resultados. En la técnica del CLSI, la determinación de los resultados se realiza visualmente bajo iluminación normal de laboratorio y, si es posible, usando un espejo invertido. En primer lugar, debe comprobarse que en los pocillos control positivo hay crecimiento fúngico suficiente; en caso contrario, se recomienda seguir incubando la placa del ensayo durante 24 h más. El que el tiempo de incubación de las placas del ensayo depende mucho de la especie fúngica analizada, en general, la mayoría de las especies de levaduras se incuban durante 24 h antes de la lectura de las placas, mientras que los hongos filamentosos se incuban durante 46 a 50 h, con la excepción de los hongos mucorales, que se incuban durante 24 h, y los dermatofitos (tales como Microsporum canis y Trichophyton spp.), que se incuban hasta 4 días.
En cuanto a la determinación de los valores de concentración mínima inhibitoria (CMI) para levaduras, la CMI de anfotericina B es la concentración más baja del compuesto que da lugar a una inhibición completa del crecimiento (disminución del 100% del crecimiento) respecto al control sin antifúngico o, en otras palabras, el primer pocillo totalmente claro. Por su parte, la CMI de flucitosina (5-fluorocitosina), azoles y equinocandinas para levaduras es la concentración más baja que da lugar a una inhibición del crecimiento de al menos el 50% respecto al control sin antifúngico. En el caso de los hongos filamentosos, tanto los azoles como la anfotericina B impiden la germinación de las esporas y, por tanto, la CMI para estos compuestos se define corresponde a la concentración más baja que produce un 100% de inhibición del crecimiento. Sin embargo, en el caso de las equinocandinas, las esporas de los hongos filamentosos son capaces de germinar, pero el crecimiento apical de las hifas emergentes se ve seriamente comprometido, lo que resulta en un cambio en el patrón de crecimiento. Por ello, para los hongos filamentosos se define la concentración mínima efectiva (CME) de equinocandinas como la concentración más baja del compuesto que conduce al crecimiento aberrante del hongo (microcolonias, formadas por hifas pequeñas y muy ramificadas) en comparación con el crecimiento miceliar (hifas largas y no ramificadas) del control positivo.
5) Controles de calidad y esterilidad. La técnica del CLSI establece diferentes sistemas de control de calidad y esterilidad para garantizar la fiabilidad del ensayo. Así, por ejemplo, se recomienda realizar recuentos en placa de las suspensiones de células o esporas en agua destilada estéril utilizadas, lo que permite comprobar la viabilidad y concentración adecuada del inóculo. Por otro lado, es recomendable introducir en las placas del ensayo cepas de control de calidad, es decir, cepas catalogadas, perfectamente caracterizadas y con fenotipo y/o genotipo estables y definidos respecto a la sensibilidad antifúngica, que pueden obtenerse de colecciones de cultivos certificadas. Los resultados obtenidos para estas cepas control de calidad deben estar dentro de los límites definidos por el CLSI. Finalmente, los pocillos de control de esterilidad (columna 12) incluidos en cada placa del ensayo sirven para garantizar que no se producen contaminaciones durante la realización de la técnica.