Estudios de sensibilidad antifúngica

Generalidades sobre los estudios de sensibilidad antifúngica

Los análisis de sensibilidad antifúngica son esenciales tanto para diseñar un buen plan terapéutico como para detectar aislamientos resistentes a antifúngicos, por ejemplo con fines epidemiológicos. Estos análisis pueden realizarse in vivo, utilizando modelos animales de infección fúngica a los que se administran antifúngicos o combinaciones de antifúngicos de manera controlada y se realiza un seguimiento de la supervivencia y otros parámetros de infección en los sujetos experimentales, o, de manera más generalizada, mediante diversos ensayos in vitro (comúnmente denominados antifungigramas). Los métodos más populares en la actualidad para realizar ensayos de sensibilidad antifúngica in vitro de hongos filamentosos y levaduras son los desarrollados por el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) y del Comité Europeo de Pruebas de Susceptibilidad Antifúngica (EUCAST). A pesar de algunas diferencias técnicas, tanto el método del CLSI como el desarrollado por el EUCAST se basan en procedimientos de microdilución en caldo donde se evalúa el crecimiento de los aislamientos fúngicos en una serie de cultivos en medio líquido que contienen concentraciones crecientes del agente antifúngico a analizar en comparación con cultivos control que no han sido expuestos a antifúngico alguno. Además de los métodos establecidos por el CLSI y el EUCAST, existen diversos sistemas comerciales para realizar ensayos in vitro de sensibilidad antifúngica, incluyendo, por ejemplo, métodos basados en el uso de tiras de papel o material plástico que contienen gradientes de concentración de un antifúngico (por ejemplo, Etest®) y métodos de microdilución en caldo en los que la lectura de resultados se realiza de manera colorimétrica (por ejemplo, Sensititre®).  Todos estos métodos de realización de antifungigramas son explicados con más detalle en otros apartados de esta Guía. En cualquier caso, los resultados de estos ensayos suelen expresarse en términos de:

• concentración mínima inhibitoria (CMI): concentración más baja (generalmente expresada en mg/L o µg/mL) de un compuesto que previene el crecimiento visible de un aislamiento fúngico dadas unas condiciones de ensayo definidas y punto final (por ejemplo, 80% o 50% de reducción en el crecimiento con respecto al control de crecimiento).

• concentración mínima efectiva (CME): concepto definido principalmente para hongos filamentosos y fármacos fungistáticos (por ejemplo, equinocandinas) y referido a la concentración más baja de dicho fármaco que da lugar a cambios morfológicos (por ejemplo, crecimiento de bolas de hifas pequeñas, redondeadas y compactas) en comparación con el crecimiento visto en los controles de crecimiento.

• concentración fungicida mínima (CFG): concentración más baja de un fármaco antimicótico requerida para lograr la muerte, generalmente definida como una reducción del 99,9% del inóculo inicial (recuento de unidades formadoras de colonias), del aislamiento fúngico analizado.

Otros conceptos importantes a tener en cuenta en los ensayos de sensibilidad antifúngica, que están directamente relacionados con el concepto de resistencia antifúngica, son el de punto de corte clínico y punto de corte epidemiológico (epidemiological cutoff value, ECV). El punto de corte clínico se refiere al valor de CMI utilizado para clasificar los aislamientos fúngicos como "sensibles" o “resistentes” a un antifúngico dado, si bien para algunas combinaciones de especie de hongo-antifúngico también se han definido las categorías de “sensibilidad dosis dependiente” o “sensibilidad intermedia”. Por su parte, el punto de corte epidemiológico es un concepto operativo que reconoce la dificultad de establecer puntos de corte clínicos para clasificar de manera precisa los aislamientos de muchas especies fúngicas como sensibles o resistentes a los distintos antifúngicos disponibles. En términos prácticos, los ECVs son los valores de CMI que dividen las poblaciones de hongos en aislamientos de tipo salvaje y aislamientos no salvajes, siendo estos últimos los que expresan fenotípicamente algún mecanismo de resistencia antifúngica y es menos probable que respondan al agente antifúngico analizado. Así pues, para un antifúngico dado, el ECV es el límite superior de la población de tipo salvaje y por lo general incluye el 95-97,5% de los aislamientos de la especie analizada. Es importante tener en cuenta que la clasificación de un aislamiento fúngico como sensible/resistente o de tipo salvaje/no salvaje frente a un determinado antifúngico no implica necesariamente que la aplicación de dicho antifúngico vaya a resultar en un éxito o fracaso clínico, ya que hay muchos factores de diversa naturaleza que van a contribuir al resultado clínico, incluidos factores del hospedador (especies animal, estado inmunitario, tipo de infección, comorbilidades, etc.), características terapéuticas (farmacocinética y farmacodinámica, régimen de dosificación, vía de administración, toxicidad, interacción con otros fármacos, etc.) y diversos factores ambientales.

Finalmente, es importante destacar que a día de hoy no hay ninguna técnica de referencia para analizar la sensibilidad antifúngica de algunos hongos de gran importancia en patología veterinaria. Tal es el caso, por ejemplo, de Malassezia pachydermatis, especie de levadura lipodependiente y de crecimiento lento para la cual es necesario modificar las técnicas de análisis de sensibilidad antifúngica comentadas anteriormente, normalmente mediante la utilización de medios de cultivo que incorporen suplementos lipídicos en su composición (por ejemplo, polisorbato 80) y ajustando los tiempos y temperaturas de incubación.

Principales métodos de análisis in vitro de sensibilidad antifúngica utilizados en Micología Veterinaria