Microdilución con resultados colorimétricos

Descripción breve de la técnica

Dentro de esta categoría de ensayos in vitro de sensibilidad antfúngica destaca el Sensititre® YeastOne®. Se trata de un método de microdilución en caldo robusto, fácil de realizar y altamente reproducible que está basado en la técnica del CLSI. Aunque este método se emplea principalmente para la determinación de la sensibilidad antifúngica de Candida spp. y otras levaduras, también funciona con hongos filamentosos, especialmente aquellos de fácil esporulación, como los miembros del género Aspergillus.

Cada ensayo de la técnica Sensititre® consta de una placa de microtitulación de 96 pocillos que contiene liofilizadas diluciones en serie de diferentes agentes antimicóticos (normalmente un compuesto diferente por fila y otro adicional en la última columna). Cada pocillo contiene además alamarBlue®, reactivo permeable a las células y no tóxico basado en la resazurina que funciona como indicador de viabilidad celular por el potencial reductor de las células vivas, lo que facilita notablemente la determinación de los resultados de la técnica mediante colorimetría (cambio de color de azul a rosa).

Para realizar la técnica, se parte de un cultivo fresco del hongo a analizar a partir del cual se prepara una suspensión en solución salina de manera similar a la explicada en las técnicas anteriores. A continuación, 20 µL de la suspensión de células (en el caso de las levaduras) o esporas (en los hongos filamentosos) son transferidos a un tubo que contiene 11 mL de caldo YeastOne® y se agita el tubo para conseguir una suspensión homogénea. Posteriormente, se dispensa la suspensión de células/esporas en caldo de cultivo en la placa del ensayo, a razón de 100 µL por pocillo, se cubre la placa con una lámina adhesiva para evitar la evaporación y prevenir posibles contaminaciones, y se pone a incubar a la temperatura y tiempo adecuado (generalmente 35ºC durante 24-48 h, si bien este aspecto varía según la especie analizada). Tras el tiempo de incubación, se debe comprobar si en el pocillo de control de crecimiento (A1) se ha producido un cambio de color (es decir, ha habido crecimiento suficiente). Si dicho pocillo permanece de color azul o ligeramente morado, se seguirá incubando la placa del ensayo 24 h más. Finalmente, se procede a determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI) frente a cada compuesto antifúngico que, en general, para compuestos fungicidas se define como la concentración más baja en la que se inhibe totalmente el crecimiento del microorganismo y, por tanto, no se produce cambio de color alguno. Por su parte, para los compuestos fungiestáticos o que dar lugan a crecimiento residual (trailing growth), que se manifiesta como un ligero cambio de color, la CMI debe leerse como la primera concentración que resulta en un cambio de color menos intenso en comparación con el pocillo de control de crecimiento.