電泳知識
電泳須有一介質,最初進行於溶液中,但因擴散嚴重經常失敗又改用濾紙,然而摩擦力太大成為一大難關;經歷一波三折後終於成功以半凝膠之方式做1出成功率較高之成果
Arne Tiselius 成功以全液相電泳分離出血球蛋白,於1948年獲得諾貝爾生理醫學獎,亦成為唯一因電泳相關知識獲得之諾貝爾獎項
問題處理
先前我們進行之電泳實驗都屬於水平電泳,然而對於蛋白質而言若是進行水平電泳則在通過凝膠乳時容易堵塞,藉由改為垂直電泳可以改善此問題,避免影響實驗
在進行電泳時需要加入SDS(為十二碳之介面活性劑)來處利蛋白質之正負分布對於實驗結果的影響,藉由將其攤平來消除問題
2.電泳分析
第一層之濃度為4%,第二層為15%,藉由濃度差及類似於解離之概念(蛋白質趨向正極移動)使目標檢體向下移動,最後可以得到蛋白質大致分子量(愈下方移動愈快,分子量愈小)
電泳槽(Buffer tank)
緩衝液(Buffer)
電極(Electrodes)
電源(Power supply)
膠體(Support media)
示踪染劑(Tracking dye)
膠體配製:
下膠材料:
H₂O...............................................4.6mL
29% Acrylamide..........................2.7mL
1.0M Tris(pH8.8)..........................2.5mL
10% SDS.......................................100μL
10% Ammonium Persulfate......100μL
1% TCE .........................................100μL
TEMED..............................................6μL
TCE
H₂O...............................................3.4mL
29% Acrylamide..........................830μL
1.0M Tris(pH6.9).........................630μL
10%SDS........................................50μL
10% Ammonium Persulfate......50μL
TEMED..........................................5μL
TEMED
實驗步驟
下膠:
1.加入所有材料到離心管
(離心管需置於冰桶當中,以防止其凝固)
2.將上一步的溶液加約7.2ml到玻璃片之間
3.在加好的溶液之上加水把溶液的上面壓平
4.靜置一段時間等他凝固就完成了
上膠:
1.先把所有材料都加進離心管(離心管需置於冰桶當中,以防止其凝固)
2.把用來壓下膠的水倒掉
3.把步驟一的溶液加入玻璃板之間
4.在最上方放齒梳
5.靜置等待一段時間後就完成了
跑膠台組裝
步驟:
1.把做好的上膠上的齒梳拆下來,並用水沖洗
2.把兩組的膠(含玻璃片)卡入盒子裡並放入電泳槽
3.加入running buffer到盒子裡和電泳槽的約三分之一處
4.蓋上蓋子並插上電極就準備好了
跑膠
步驟:
1.把dye分別加入MK、BSA(1μg)、BSA(2μg)、casein(1μg)和casein(2μg),並把它們分別加到上膠的well裡
2.接上電源,電壓調到90V,等待約30分鐘
3.把電壓升高到180V,等待直到跑完完為止
4.把膠體取出,並用塑膠鏟把上膠和下膠分開
5.把上膠丟掉,並把下膠放到裝有水的盒子,然後拍照
我們這次的實驗結果(左邊五格)可以說是沒有東西,雖然終點處有一條亮亮的線,但是中間的過程該出現的橫條一個都沒出現。這次除了我們之外,其他組也都是類似的狀況。我們推測可能造成的原因是sample的濃度太低導致拍照拍不到,或是因為我們在做下膠時其實多放了很多的下膠,也可能是造成沒有結果的原因。
因為沒有人做出結果,所以助教打算自己再做一次。
這堂課有別於之前常見的橫式的色素電泳、DNA電泳,這次我們所學的是直立式的蛋白質電泳。由於蛋白質的結構複雜且不帶電,因此在電泳之前還需加入許多藥劑以幫助其解開結構使其成線性並使其帶電,這是個全新的體驗,在實驗中也有更多的細節需要講究,雖然過程中我們有發生錯誤,最後也沒跑出結果,但這也是一個經驗,實驗怎麼可能永遠都一次就成功,透過這次的實驗,我們從中學到了蛋白質電泳這項技術,了解其背後的原理,在操作錯誤後也讓我們對之後的實驗步驟更加小心,確保每個步驟都是正確的,而思考失敗的原因也是在這堂課中練習到的做實驗時很重要能力。
操作錯誤:下膠的量放超過7.2ml
(可能是在加的時候次數數錯)