蛋白質電泳分析

研究原理

1. 凝膠製備：

首先，根據需要的分子量範圍，調配不同濃度的acrylamide mix。acrylamide是一種單體，可以聚合形成聚丙烯醯胺凝膠。通常使用兩種不同濃度的凝膠，即堆膠凝膠（stacking gel）和分離凝膠（separating gel）。

- 堆膠凝膠：使用較低濃度的acrylamide mix（1.0M）和較高pH值（例如Tris缓冲液，pH 6.9）製備。為將待測樣品聚焦在一個窄的區域內，以增加分辨率。

- 分離凝膠：使用較高濃度的acrylamide mix（1.5M）和較低pH值（例如Tris缓冲液，pH 8.8）製備。用於進一步分離蛋白質並測定其分子量。

2. 混合物製備：

- 混合堆膠凝膠：將acrylamide mix、tris緩衝液（pH 6.9）、SDS、TCE（三氯乙酸）等混合。其中，SDS被用作變性劑，使蛋白質呈現線性構型，而TCE則用於增加凝膠堆積效果。

- 混合分離凝膠：將acrylamide mix、tris緩衝液（pH 8.8）、SDS等混合。SDS使蛋白質呈現線性構型。

3. 引發劑：

在混合堆膠凝膠和分離凝膠中添加引發劑，例如APS（過硫酸銨）和TEMED（N,N,N',N'-四甲基乙二胺）。APS是自由基的提供者，而TEMED是幫助傳遞自由基的催化劑，兩者一起觸發蛋白質和acrylamide的聚合反應，形成凝膠結構。

4. 裝載樣品：

將混合的蛋白質樣品加載到製備好的凝膠的孔洞中。通常還會加載分子量標準品，以用於分子量的校準。

5. 電泳：

將裝載好樣品的凝膠放入電泳槽中，注入Tris-glycine緩衝液作為電解質緩衝液。連接電泳槽的正負極，形成電場。應用電場後，蛋白質在凝膠中根據其分子量進行遷移，較小的蛋白質遷移速度較快，而較大的蛋白質則遷移速度較慢。

6. 分析：

通過比較待測蛋白質帶狀條帶的位置和強度，可以進行定性和定量分析。將待測蛋白質的遷移距離與分子量標準品的遷移距離進行比較，從而確定待測蛋白質的相對分子量。

研究心得

不知道甚麼原因，我們的膠體在第一步就失敗了。應該成完美水平面的下膠雖然有部分凝固，卻呈現一種奇妙的海浪狀。我們猜想是因為在注入下膠液體時我們加錯量，而助教補救的過程有加入水使比例失衡導致。結果經詢問他組，竟然有一半的組別有相同的問題! 這也代表這個實驗才剛開始，就有 50% 的失敗率!

為了讓所有同學皆能操作到實驗，最後助教決定讓失敗組從有成功的組借膠體，倆倆共享。我萬萬沒想到問題還沒結束，配置上膠時看起來一切安好，沒想到有兩組的膠再度沒凝固! 原本我想，完蛋了，現在實驗成功率只剩下 25% 了，但在助教一翻搶救下這次終於順利「救活」那兩塊膠。幸好在這之後沒再出甚麼大問題，除了因為井太深，牆太脆弱，在注射 sample 時要很小心外，我們的實驗總算圓滿地完成了。