細菌染色

關於染色

因微生物個體小菌體在水溶液中近乎透明，故難以在活體狀態下觀察，因此需染色後再進行鑑別菌種

染色方法主要分成三種:

1. simple staining

2. negative staining

3. gram staining

染色方法

simple staining

原理:

此方法主要是透過使用鹽基性染料對細菌進行染色，以觀察細菌的形態和排列。染料中的陽電荷能夠與細菌帶有負電荷的核酸和細胞壁成分結合。常用的鹽基性染料包括甲烯藍、龍膽紫（或結晶紫）和石炭酸複紅，染色時間則根據不同染料而有所不同，通常在幾秒到幾分鐘之間。這種染色方法有助於觀察細菌細胞的特徵和結構。 

以菌種E. coli為例的步驟如下

1.以熱固定法將菌體固定於載玻片上

2.因細菌核酸與細胞壁某些成分具負電，以帶正電的結晶紫試劑覆以染色液

3.等待60秒後，以蒸餾水尖嘴瓶小心沖去過剩染色液(玻片應與水流成平行，以減少微生物自抹片中流失)  

gram staining

原理:

基於細菌細胞壁的結構差異以及染料的互作用，可區分細菌革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。

革蘭氏陽性菌:細胞壁肽聚醣層較厚，亦保留染劑於內，染後呈紫色/藍紫色

革蘭氏陰性菌:細胞壁肽聚醣層較薄，不易保留染劑，染後呈紅色

以菌種E. coli為例的步驟如下(染後皆用蒸餾水沖洗)

1.初染:  結晶紫 10s

染色部位主要為染細胞壁上的肽聚醣。

2.媒染:  碘液 10s

使形成不溶性的結晶紫-碘複合體。細菌呈紫黑色。可分辨細菌的革蘭氏染色特性。若為革蘭氏陽性菌，此複合體結合於細胞壁之鎂、核糖核酸，形成鎂-核糖核酸-結晶紫-碘複合體，以固定染劑。

3.去色:  95%酒精 10s

以95%酒精脫色，試劑具脂溶劑和蛋白脫水劑之雙重功能。因革蘭氏陽性細菌厚厚的細胞壁聚醣層次多，交聯緻密，故遇脫水時網孔縮小，再加上不含類脂，使得乙醇不會溶出縫隙，故仍然呈紫色的結晶紫-碘複合體留在細菌體內，不會褪色。反之，革蘭氏陰性菌細胞壁層薄，外膜類脂含量高、肽聚醣層薄和交聯度差，在遇脫色劑時，以類脂爲主的外膜迅速溶解，薄而鬆散的肽聚醣網不能阻擋複合體溶出，因此會被脫色而成為無色。

4.回染:  番紅 10s

為了對比，在此之後會加入番紅進行複染，將革蘭氏陰性菌染成紅色，而革蘭氏陽性菌仍保有原來的紫色

p.s. 我們的番紅染劑沒有染色