Abstract 2019

フィロジェノミック解析により推測された Microheliella maris の系統的位置

真核生物がどのように多様化したのか、また現存の系統のうちどの系統がもっとも原始的なのか等の真核生物大系統間の系統関係は、地球上の生物進化を理解する上で不可欠な情報である。これまでの解析で系統的位置がはっきりと解明されていない‟orphan 生物”の中には真核生物の初期分岐を解明する上でカギを握る生物が含まれる可能性が高い。本研究では、orphan 生物の一種であるMicroheliella maris の系統的位置を、338 遺伝子データに基づくフィロジェノミック解析により検討した。M. maris は軸足をもつアメーバ状真核微生物の一種であり、これまでに詳細な顕微鏡観察と187 遺伝子データに基づく分子系統解析がおこなわれたが、その系統的位置を確定することが出来なかった。本研究では M. maris からトランスクリプトームデータを取得し、この配列データを用いて338 遺伝子から構成される分子系統解析用アライメントを作成した。この 338 遺伝子データを最尤法により解析したところ、①M. maris はクリプチスタ生物群にふくまれるクリプト藻、ゴニオモナス類、カタブレファリス類、Palpitomonas bilix とともにブートストラップ値 100%で支持される単系統群を形成すること、②このクレード中で M. maris は最も基部から分岐することが判明した。典型的なクリプチスタの形態的特徴をもたない M. maris がクリプチスタ生物と極めて強い近縁性を示したことから、クリプチスタの初期進化、さらには真核生物の初期進化を理解する上で重要な生物であると考えられる。

Evolution from covalent conjugation to non-covalent interaction in the ubiquitin-like ATG12 system

Autophagosome formation involves two ubiquitin-like conjugation systems, the ATG12 and ATG8 conjugation systems. In general, ubiquitin and ubiquitin-like proteins can be covalently conjugated to multiple target proteins to participate in various cellular functions, and eventually deconjugated to be released from the target proteins. However, the ATG12 and ATG8 conjugation systems have distinctive features: the ubiquitin-like protein ATG12 is covalently conjugated to its sole substrate ATG5 to provide the ATG12–ATG5 conjugate that is never deconjugated and thus behaves like a single protein, and the ubiquitin-like protein ATG8 is attached to the phospholipid phosphatidylethanolamine (PE) by a ubiquitylation-like mechanism dependent on the E3-like function of the ATG12–ATG5 conjugate. Here, we focus on the fact that ATG12 has only one substrate ATG5, which raises the question whether ATG12 and ATG5 have to be linked via a covalent bond rather than a simpler non-covalent interaction. In this study, we show that the apicomplexan parasites Plasmodium and Toxoplasma and the methylotrophic yeast Komagataella phaffii (previously known as Pichia pastoris) have neither the E2-like enzyme ATG10 nor the C-terminal glycine of ATG12, both of which are required for covalent conjugation. Instead, ATG12 in these organisms forms a non-covalent complex with ATG5. The non-covalent ATG12–ATG5 complex still retains its original E3-like function facilitating ATG8–PE conjugation and is essential for autophagy in vivo. These findings indicate that evolutionary transition from covalent conjugation to non-covalent interaction has occurred in the ubiquitin-like conjugation system. We assume that ubiquitin-like covalent conjugation can evolve to a simpler non-covalent interaction, most probably when it has a limited number of targets, as is the case in the ATG12 conjugation system (Pang, Yamamoto, et al. (2019) Nat. Struct. Mol. Biol.).

ゼロから始める大規模分子系統解析

原生生物研究において、研究対象生物の正確な系統的位置を知ることは非常に重要である。これまでの研究においては、系統的位置を推測する方法として、SSU rDNAなどの真核生物に保存的な分子マーカーを用いた単一遺伝子系統解析が広く行われてきた。しかし、対象生物が真核生物進化の比較的早期に分岐したと考えられる場合や既存の系統に属さない場合は、単一遺伝子の情報量ではその系統的位置を正確に推測できないことが多い。この問題に対する、一つの解決策が大規模分子系統解析である。近年のシーケンス技術の長足な発展で、大規模配列データを簡便に取得でき、200を超える遺伝子セットによる大規模分子系統解析が可能となった。実際に、系統的帰属が不明な新奇真核生物の系統的位置が続々と解明されてきている。今回、大規模分子系統解析の概要とそのケーススタディを紹介し、新しく原生生物研究を始めた研究者への大規模分子系統解析を始める足掛かりとしたい。

ATG12-ATG5における共有結合非依存化の普遍性について

オートファジーは多くの真核生物に備わる細胞内の大規模分解機構であり、ATG因子群の働きによって形成されるオートファゴソームによって仲介される。サッカロミセス酵母や哺乳類細胞を用いた研究から、ユビキチン様タンパク質ATG12のC末端グリシンがATG5と共有結合し、この共有結合体がもうひとつのユビキチン様タンパク質であるATG8の脂質化を促進することがオートファゴソーム形成に必要であることが分かっている。これらはマラリア原虫を含むアピコンプレクサ類では独自のオルガネラであるアピコプラストの生合成に必要でもある。また、陸上植物や哺乳類と極めて離れた系統に同様の機構が保存されていることから、真核生物初期に獲得されたと考えられている。しかし、我々は最近、アピコンプレクサ類や酵母に近縁な一部菌類（コマガタエラ酵母など）で共有結合に必要なATG12のC末端グリシンやATG10を喪失しており、ATG12はATG5と非共有結合性の複合体を形成してATG8の脂質化を促進していることを報告した。つまり、ATG12とATG5は適切な結合面さえ獲得できれば必ずしも共有結合しなくても機能しうる。このようなATG12 - ATG5間の共有結合非依存化が機能上中立ならば、真核生物の進化上2つのATG因子の結合形態の変化が頻繁に起こってもおかしくない。そこで、本研究ではATG12とATG5の結合様式を真核生物全体で検証した。真核生物系統の多様性を網羅した130生物種のトランスクリプトームデータに対して、ATG5、8、10、12ホモログを配列相同性によって探索した。ATG10が検出できなかった種やC末端がグリシンではないATG12をもつ種が多数同定され、それらは真核生物系統樹上に散在していることが判明した。この結果から、広範な真核生物系統でATG10の喪失が少なくとも独立に34回以上、ATG12のC末端グリシン残基の変異も9回以上独立に起きたとことが予測された。また、全てのATG12のC末端の変異はATG10が喪失した系統内で起きていることから、ATG12のC末端の変異はATG10の喪失の後に生じるという順次性があることが示唆された。これらの結果から、真核生物進化上ATG12 - ATG5間の共有結合は頻繁に喪失しうると考えられる。

Phylogenomic analysis assessing the positions of “orphans” including Microheliella maris. 

Deep branching lineages in the tree of eukaryotes are potentially represented by some of “orphan” species, of which phylogenetic positions remain uncertain in previous studies. In this study, we generated transcriptomic data from “orphans” including a heliozoan-like unicellular eukaryote (protist) Microheliella maris, and assembled a phylogenomic alignment containing 338 genes (98,904 amino acid positions in total). Maximum-likelihood (ML) analyses of “338-gene” alignment robustly reconstructed major taxonomic assemblages, such as (1) SAR, (2) Haptista, (3) Cryptista, (4) Discoba, (5) Metamonada, (6) CRuMs and (7) Amorphea. M. maris was placed at the basal position of the Cryptista clade (including Palpitomonas blix) with full statistical support. As little morphological characteristic is shared between M. maris and cryptists, it is not appropriate to consider M. maris as a member of Cryptista. Rather, M. maris likely hints a previously overlooked lineage that is closely related to Cryptista. Besides M. maris, two undescribed “orphans” were placed separately within CRuMs, and another “orphan” was united with malawimonads in 338-gene phylogeny.

Evolutionary distinct gene-sets for autophagosome formation in dinoflagellates harboring endosymbiotic diatoms. 

Autophagy is an intracellular degradation mechanism by which cytoplasmic materials are delivered to and degraded in the lysosome and proposed to have been established at an early stage of eukaryotic evolution. Dinoflagellates harboring endosymbiotic diatoms (so-called “dinotoms”), which retain their own nuclei and mitochondria in addition to plastids, have been investigated as an intermediate toward the full integration of a eukaryotic alga into the host-controlled organelle (i.e. plastid). Pioneering studies systematically assessed the degree of the host governance on a number of metabolic pathways in dinotoms. However, little attention has been paid to the impact of the endosymbiotic lifestyle on the autophagy operated in the diatom endosymbiont. In this study, we searched ATG3, 4, 5, 7, 8, 10 and 12, which are required for autophagosome formation, in the RNA-seq data from two different dinotom-harboring dinoflagellates. We detected two sets of the ATG homologues in each of the two RNA-seq data -- one was placed within the clades of the homologues of free-living diatoms and the other showed an intimate affinity to the dinoflagellate homologues. These results suggest that dinotom-harboring dinoflagellates maintain two evolutionarily distinct sets of the factors for autophagosome formation, one of which is most likely operated in the cellular compartment derived from the endosymbiotic diatom. To examine whether the diatom endosymbionts operate autophagy that is equivalent to those in yeasts and mammals, we need to survey the factors involved in initiation and protein degradation for autophagy.

新奇原生生物SRT308 株が明らかにするユーグレノゾアの初期進化

ユーグレノゾアはディスコバに属する原生生物の一群であり、光合成性の藻類であるユーグレナ類を始めとして、ヒトの病原体として知られるTrypanosomaを含むキネトプラスト類や、海産の藻類捕食者であるディプロネマ類等を含む巨大な分類群である。ユーグレノゾアは鞭毛に付随するパラキシアルロッド、管状の射出装置や円盤状のミトコンドリア（Mt）クリステ等によって他のディスコバ生物とは明確に区別される。また、Mtゲノムは他のディスコバ生物に比べて少数の遺伝子をコードしており、系統ごとに特徴的な構造を有することが知られている。今回我々はユーグレノゾアの特異な細胞構造及びMtゲノムの進化を明らかにするため、ユーグレノゾアに近縁な新奇原生生物であるSRT308株について分子系統解析、微細構造観察及びMtゲノム解析をおこなった。153遺伝子を用いた分子系統解析からは、SRT308株はユーグレノゾアの最も基部から分岐することが明らかとなった。電子顕微鏡観察からは、本生物がユーグレノゾアとよく似た微小管性鞭毛根や円盤状のMtクリステをもつ一方で、パラキシアルロッドや管状の射出装置を欠いていることが示された。Mtゲノム解析からは、SRT308株がユーグレノゾア以外のディスコバ生物に見られるような典型的な環状のMtゲノムをもち、比較的少数の遺伝子をコードしていることが明らかとなった。本発表では、今回明らかになったSRT308株の特徴から、ユーグレノゾアの初期進化を考察する。

有孔虫の大規模分岐年代推定

「生物はいつ誕生したのか？」これは古生物学だけでなく地球科学においても根幹的な問いである。祖先真核生物が誕生し、現在の主要真核生物系統に多様化していったことは議論の余地はないが、それではこの進化いつどのようにして起こったのであろうか？近年の大規模遺伝子解析により、主要真核生物系統の系統関係は明らかになりつつある。しかし、その分岐時期に関してはいまだに高精度に推定されているとは言い難い。その理由として、a)曖昧な化石記録、b)分類群サンプリングの偏りが挙げられる。この問題を解決することで分岐年代推定の解像度が改善されるかを検証するために、堅牢な化石記録を持つ微化石生物に着目し、有孔虫・放散虫・珪藻・渦鞭毛藻を含む真核生物主要系統であるSARグループの大規模分岐年代推定を行うことにした。しかし、微化石生物の中で有孔虫の分子データは非常に限られており、そのことで有孔虫内の系統関係もあやふやな状態であった。そこで、有孔虫の分子データを拡充し、①有孔虫内の系統関係を明らかにし、②堅牢な化石記録に基づき、分類群サンプリングも十分に行ったSARグループの大規模分岐年代推定を行った。その結果、①有孔虫内の系統関係を高い系統学的支持で復元することに成功し、②放散虫と有孔虫の分岐時期がカンブリア紀前期（502-523 Ma）であることがわかった。これは捕食者の目が発達した時代であり、捕食圧が高まったことが放散虫と有孔虫の分岐を促したことがわかった。また、放散虫・有孔虫ともに硬殻を持つ系統がその直後に出現しており、硬殻が外敵の防御から獲得された形質であるとすると、高い捕食圧が放散虫と有孔虫の進化を加速させた可能性が示唆された。