Die erste Reaktion beim Bodenstickstoffkreislauf ist die Stickstofffixierung. Hier wird elementarer Stickstoff, meistens aus der Luft, fixiert und zu Ammoniak reduziert. Pflanzen und andere Eukaryonten können keinen elementaren Stickstoff verarbeiten, obwohl dieser ein wichtiger Nährstoff für die Pflanzen darstellt. Deshalb ist es wichtig, dass andere Organismen diesen Schritt für sie übernehmen. Auch Bakterien, in diesem Fall Azotobacter, benötigen Stickstoff. Anders als die meisten Eukaryonten können Azotobacter elementaren Stickstoff fixieren, dies jedoch unter einem sehr hohen Energieverbrauch. Gerade wegen diesem hohen Energieverbrauch fixieren die Azotobacter den elementaren Stickstoff nur, wenn sie ihn wirklich benötigen.
Jedoch wird durch symbiotische Stickstofffixierung (z.B. Knöllchenbakterien, die mit den Wurzeln einer Pflanze eine Symbiose eingehen) deutlich mehr Stickstoff produziert, als durch asymbiotische, wie durch die Azotobacter. Denn diese produzieren durschnittlich etwa 10kg Stickstoff/Hektare, wohingegen die symbiotischen Fixierer durchschnittlich 10-300 kg Stickstoff/Hektar produzieren.
Azotobacter brauchen Stickstoff um wachsen zu können. Deshalb ist die Stickstofffixierung elementar für ihr Überleben, obwohl sie auch andere Stickstoffquellen, wie zum Beispiel einfache Stickstoff-Verbindungen wie Nitrate, Harnstoff und Ammoniak, nutzen können. Jedoch sind Azotobacter aerobe Bakterien, was bedeutet, dass sie Sauerstoff zum Überleben brauchen. Zudem sind sie eine der seltenen Bakteriengattung, die eine Stickstoffixierung unter aeroben Bedingungen vollziehen können.
Um Stickstoff fixieren zu können, braucht es das Enzym Nitrogenase, welches elementaren Stickstoff zu Ammoniak abbaut. Nitrogenase ist jedoch stark sauerstoffempfindlich. Da die Azotobacter aerob sind, sprich Sauerstoff benötigen, entsteht hier ein Konflikt. Die Sauerstoffkonzentration innerhalb der Zelle wird deshalb durch eine intensive Atmung, sowie durch eine Schleimkapsel gering gehalten. Unter diesen Bedingungen (geringe Sauerstoffkonzentration) stoffwechseln und wachsen die Azotobacter besonders gut.