In einem zweiten Versuch haben wir die Urease-Aktivität in verschiedenen Bodenproben untersucht. Der folgende Versuch diente zur Bestimmung der Freisetzung von Ammonium aus vorgelegter Harnstofflösung während einer 2-stündigen Bebrütung bei 37 °C durch Urease Aktivität im Boden. So konnten wir indirekt daraus schliessen, in welcher Bodenprobe am meisten Urease vorhanden war.

Versuchsaufbau

Zuerst stellten wir alle für den Versuch notwendigen Lösungen her. Für die Harnstofflösung lösten wir 2.4 g Harnstoff in 500 ml dest. Wasser. Für die KCI-Lösung mussten 74.6 g KCI in dest. Wasser lösen, 10 ml 1 N HCI (32% HCl entspricht 10 N) zugeben und auf 1000 ml mit dest. Wasser auffüllen. Für die Na-Salicylat/NaOH-Lösung mussten wir zuerst eine NaOH (0.3 N)-Lösung und eine Na-Salicylat-Lösung herstellen. für die Na-Salicylat-Lösung lösten wir 17g Na-Salicylat und 120 mg Nitroprussid-Natrium in 100 ml dest. Wasser. Die NaOH (0.3 N)-Lösung stellten wir mit 12 g NaOH her, das wir in dest. Wasser lösten und auf 1000 ml auffüllen. Danach mischten wir diese beiden Lösungen im gleichen Volumenteile gaben und dest. Wasser dazu. Um das Oxidationsmittel herzustellen, gaben wir 0.1 g Dichlorisocyanursäure Natriumsalz-Dihydrat in 100 ml dest. Wasser. Die Ammonium-Eichlösung besteht aus einer Vorratslösung und einer Gebrauchslösung. Um die Vorratslösung herzustellen lösten wir 3.82 g Ammoniumchlorid in 1000 ml dest. Wasser. 1 ml dieser Lösung entspricht 1000 µg NH4-N. Die Gebrauchslösungen stellten wir folgendermassen her: wir gaben jeweils 1.0, 1.5,2.0, 2.5 ml der Vorratslösung in einem 100 ml Masskolben und füllten bis zur Marke mit KCl-Lösung auf. Die N- Standards entsprechen folgenden Konzentrationen 10, 15, 20, 25 ug NH4-N/ml.

Hatten wir die Lösungen einmal hergestellt, konnten wir mit dem eigentlichen Versuch beginnen. Dazu gaben wir je 5 g naturfeuchten Boden in je 3 Erlenmeyerkolben (100 ml) und befeuchteten diese mit 2.5 ml Harnstofflösung. Die Erlenmeyerkolben verschlossen wir mit Stopfen verschlossen und liessen die Bodenproben 2 Stunden bei 37 °C in einem Brutschrank bebrütet. Die Blindwerte bekommen an Stelle von Harnstoff 2.5 ml dest. Wasser und werden wie die Vollansätze behandelt. Nach der Inkubation versetzten wir alle Proben mit 50 ml KCl-Lösung (den Blindwerten wird zusätzlich jeweils 2.5 ml Harnstofflösung zugesetzt) und stellten sie für 30 min auf einem Horizontalschüttler. Anschliessend filtrierten wir alle Suspensionen (die Filter müssen stickstofffrei sein).Es entstanden drei klare Filtrare. Von den klaren Filtraten übertrugen wir je 1 ml in ein Reagenzglas. In die Reagenzgläser gaben wir 9 ml dest. Wasser, 5 ml Na-Salicylat/NaOH-Lösung und 2 ml Oxidationsmittel. Danach liessen wir die Reagenzgläser für 30 min stehen. Die Lösungen verfärben sich. Nach der Anfärbung massen wir die Lösungen bei 700 nm gegen den 0-Wert der Eichkurve. Zur Aufstellung der Eichkurve pipettierten wir je 1 ml der Gebrauchslösung in Reagenzgläser und verdünnten mit 9 ml dest. Wasser. Die Ammoniumbestimmung erfolgt wie bei den Bodenproben. Die einzelnen Eichpunkte entsprechen folgenden Konzentrationen: 1, 1.5, 2,2.5 µg NH4-N/ml (die Eichkurve ist bis 3.5 µg /ml linear).

Diskussion

Nach einer zweistündigen Inkubation der Bodenproben mit einer ungepufferten Harnstofflösung wird das gebildete Ammonium mit einer 1 M Kaliumchloridlösung extrahiert und kolorimetrisch bestimmt. Die Farbreaktion basiert auf einer modifizierten Berthelotschen Reaktion.

Die Konzentration von Ammoniak in den Bodenproben wird durch ein Spektrometer gemessen. Das Spektrometer misst die Farbintensität von sichtbarem Licht, das vom Ammoniak emmitiert wird und gibt dafür einen bestimmten E-Wert an. Damit man aber mit dem Spektrometer überhaupt einen E-Wert messen kann, muss das Ammoniak erst gefärbt werden. Ammoniak in Wasser ist farblos, denn Ammoniak absorbiert und emittiert nicht im sichtbaren Bereich, sondern im UV-Bereich, so würde das Spektrometer für ungefärbte Ammoniak einen E-Wert von 0 angeben.

Mit Hilfe des E-Werts und der Eichkurve kann man auf die Konzentration von Ammoniak schliessen. Die Farbe einer organischen Verbindung hängt davon ab, wie viele pi-Elektronen delokalisiert sind. Je höher der Grad der Delokalisierung ist, desto farbiger erscheint eine Verbindung, deshalb muss Ammoniak über ein delokalisiertes Doppelbindungssystem verfügen. Die Berthelot-Reaktion ermöglicht diesen Prozess. Durch die Berthelot-Reaktion reagiert Ammoniak durch ein paar Schritte zu Indophenol.

Da die Reaktion im alkalischen Bereich stattfindet (pH>12), liegt das Gleichgewicht der folgenden Reaktion auf der Seite des Ammoniaks:

Das bei unserem Experiment entstandene Ammoniak (vergleiche Theorie zu Urease) reagiert zuerst mit Dichlorisocyansäure zu Monochloramin:

Im dritten Schritt reagiert das Monochloramin mit Natriumsalicylat durch Zusatz von Nitroprussidnatrium als Katalysator zu N-Chlor-chinon-monoimin:

Im vierten Schritt reagiert N-Chlor-chinon-monoimin mit einem weiteren Natriumsalicylat-molekül zum entsprechenden Indophenol. Im alkalischen Medium verleiht das Indophenol der Lösung eine intensive Blaufärbung, das heisst, dass es im sichtbaren Bereich absorbiert und emittiert. .

Schliesslich misst das Spektrometer die Farbintensität des blaugefärbten Indophenol in den Bodenproben und gibt einen bestimmten E-Wert für jede Bodenprobe an. Diese gemessenen E-Werte werden in die Eichkurve integriert, sodass jeder E-Wert einer bestimmten Konzentration an NH₄⁺ eingeordnet werden kann. Dadurch kann eine quantitative Ausssage darüber gemacht werden, wie viel NH₄⁺ von den in der Bodeprobe vorkommenden Mikroorganismen produziert wurde. Die produzierte Menge an NH₄⁺ weist indirekt darauf hin, in welcher Bodenart am meisten bzw. am wenigsten stickstofffixierende Bakterien existieren, da Ammonium-Ionen nur durch diese Bakterien im Boden produziert werden kann. Je mehr Ammonium freigesetzt wird, desto mehr stickstofffixierende Bakterien müssen in der Bodenprobe vorhanden sein. Durch die Messungen haben wir festgestellt, dass die Fettwiese den höchsten E-Wert aufweist und somit am meisten stickstofffixierende Bakterien enthalten muss. Ebenfalls weisen die Messungen darauf hin, dass die Magerwiese mehr NH₄⁺ produziert, als der Waldboden. Dies widerspricht sich aber der Theorie. Ein möglicher Grund für diesen Fehler könnte sein, dass der Waldboden von der Oberfläche des Bodens genommen wurde. Die stickstofffixierenden Bakterien befinden sich eher in einem tieferen Bereich des Bodens. Hätte man eine Bodenprobe des Waldbodens aus einer tieferliegenden Schicht genommen, wären die E-Werte eventuell auch höher gewesen. Ein anderer möglicher Grund wäre das Messgerät selbst. Die Anleitung zur Bedienung des Geräts war sehr unverständlich und wir hatten Problem damit, das Gerät richtig zu nutzen. Ein anderer möglicher Grund könnte sein, dass die Experiment-Bedingungen (z.B. Temperatur, pH-Wert etc.) die Aktivität der stickstofffixierenden Bakterien in den Waldboden-Proben beeinflusste haben könnten, da die Laborbedingungen mit den natürlichen Bedingungen nicht übereinstimmen. Das heisst: unsere erzeugten Bedingungen könnten die Aktivität der Bakterien verlangsamt haben.

Was noch zu beachten ist, sind die Werte der Eichkurve. Zur Herstellung der Eichkurve wurden 4 Lösungen mit verschiedenen Ammonium-Ionen Konzentrationen (1, 1.5, 2 und 2.5 µg NH4-N/ml) genutzt. Wie man der Grafik aber entnehmen kann sind nur zwei Werte, nämlich 1 und 1.5 µg NH4-N/ml, in der Eichkurve aufgeführt (siehe Resultate). Bei den anderen Lösungen (2, 2.5 µg NH4-N/ml) ist ein Fehler während der Reaktionen aufgetreten, denn sie haben sich nicht grün gefärbt (siehe Resultate 2. Bild rechts). Daher haben wir ihre gemessenen E-Werte und Konzentrationen nicht in die Eichkurve eingefügt.

Was noch einen Einfluss auf die Resultate des N-Standards der Eichkurve haben könnte, ist die photometrische Genauigkeit des Spektrometers. Diese Genauigkeit des Photometers liegt im Bereich 0.1 – 2.0 E bei 20 °C. Die Ammoniumlösung mit der Konzentration von 2 µg NH4-N/ml hatte den E-Wert von 2.003 ergeben. Die Lösung von 2.5 µg NH4-N/ml (was eigentlich ein höherer E-Wert ergeben sollte als bei 2 µg NH4-N/ml , da die Konzentration von Ammonium-Ionen höher ist als bei 2 µg NH4-N/ml) hatte einen E-Wert von 1.965. Zwar haben wir schon angenommen, dass während den Reaktionen der beiden Lösungen der Konzentrationen 2 und 2.5 µg NH4-N/ml ein Fehler aufgetreten ist, aber wenn sie ganz richtig gelaufen gewesen wären, wurde das Spektrometer Messungen nicht ganz stimmen.

https://de.m.wikipedia.org/wiki/Berthelot-Reaktion

Buch: Methodenhandbuch Mikrobiologie, Kassem Alef, 1991