DETERMINAZIONE DEI POLIFENOLI NELL'OLIO DI OLIVA

Con il termine polifenoli si indica un’ampia gamma di prodotti naturali che possiedono un anello benzenico legato ad uno o più gruppi ossidrilici. I gruppi ossidrilici possono essere liberi o funzionalizzati attraverso legami con molecole più complesse; un esempio tipico è il legame con una molecola di glucosio. Questo tipo di struttura chimica conferisce ai polifenoli un certo carattere idrofilo.[1]

Una buona parte della frazione insaponificabile dell’olio di oliva è costituta da polifenoli. Questa classe di composti riveste una grande importanza sia per le loro proprietà antiossidanti che per la loro influenza sulle caratteristiche organolettiche dell’olio. Alcuni particolari polifenoli, infatti, sembrano essere responsabili del gusto amaro e piccante dell’olio. La maggior parte dei composti polifenolici presenti nell’olio di oliva appartiene ad una delle classi di composti riportata nella Tabella 1.[2]

I composti fenolici prevalenti nell'olio di oliva appartengono alla classe dei secoiridoidi (costituiti da una molecola di acido elenolico legata ad un alcol fenolico) e dei lignani. Uno dei secoiridoidi più abbondanti nell’olio di oliva, ad esempio, è l’oleuropeina, la cui formula di struttura è riportata in Figura 1:

I composti fenolici nell’olio oliva possono andare incontro a varie reazioni che ne comportano la degradazione. Alcune di queste reazioni sono positive per l’olio perché in questi casi i composti fenolici svolgono un effetto antiossidante, basato sulla loro capacità di intrappolare i radicali perossidici che sono estremamente dannosi in quanto possono reagire con le catene degli acidi grassi portando alla formazione di perossidi che danno origine a prodotti di degradazione che comportano un’alterazione del prodotto. Il contenuto di polifenoli presenti nell'olio è quindi un indice di qualità dell'olio stesso in quanto un'elevata concentrazione di polifenoli, oltre a contribuire al potere nutraceutico dell'olio, previene in maniera più efficace l'alterazione del prodotto stesso dovuta ai processi ossidativi.

La determinazione analitica qualitativa e quantitativa dei polifenoli può essere condotta mediante metodi cromatografici (es. HPLC) che permettono di separare i diversi componenti e di determinarne le rispettive concentrazioni. In questo caso viene proposta una determinazione analitica basata sulla spettrofotometria UV-Vis che permette di valutare il contenuto di polifenoli totale, senza discriminare le diverse classi di composti.

Si determina il contenuto totale di polifenoli per via spettrofotometrica su un estratto idroalcolico trattato con uno specifico reattivo cromogeno (reattivo di Folin-Ciocalteu) che, in presenza di polifenoli, genera un composto di colore blu che presenta un massimo di assorbimento intorno a 750 nm. La retta di taratura viene costruita utilizzando come standard soluzioni a concentrazioni note di acido gallico.

Nota: il reattivo di Folin-Ciocalteu reagisce con tutti i composti che sono in grado di dare la stessa reazione che, potenzialmente, non è detto che siano per forza polifenoli. In generale, anche se i polifenoli sono i principali responsabili della riduzione del reattivo di Folin-Ciocalteu, bisogna ricordare che questo metodo non è specifico.

Reagenti

• Reattivo di Folin-Ciocalteu diluito 1:10 in acqua a partire dal reattivo commerciale Sigma-Aldrich.

• Soluzione acquosa al 7,5 %m/V di carbonato di sodio (sciogliere 7,5 g di Na₂CO₃ in 100 mL di acqua deionizzata).

• n-esano (o in alternativa n-eptano).

• Miscela idroalcolica metanolo/acqua (70:30 v/v)

• Acido gallico in polvere

Attrezzature

• Spettrofotometro UV-Vis

• Centrifuga

• Bilancia analitica (+/- 0.0001 g)

• Matracci da 25 mL

• Siringhe con filtri di Teflon da 0.45 mm

• Vetreria di laboratorio di uso comune

Nota sul reattivo di Folin-Ciocalteu

Questo reattivo è costituto da una soluzione acquosa ottenuta miscelando in ambiente acido per acido fosforico un sale di tungsteno (tungstato di sodio Na₂WO₄∙2H₂O) e di molibdeno (molibdato di sodio Na₂MoO₄∙2H₂O). In queste condizioni si forma un polianione, una struttura complessa dove più unità di tungstato e molibdato si legano tra loro in cui sia il Molibdeno che il Tungsteno si trovano allo stato di ossidazione VI. Quando questi anioni vengono a contatto con i polifenoli (che hanno proprietà riducenti), il Molibdeno passa dallo stato di ossidazione VI a V dando origine ad un composto che assume una colorazione che va dal giallo al blu intenso. La cinetica di questa reazione è piuttosto lenta a pH acidi, per questo motivo per aumentare la velocità di reazione e avere uno sviluppo di colore stabile in tempi ragionevoli è necessario neutralizzare l’acidità della miscela aggiungendo un agente basificante (generalmente si utilizza una soluzione di bicarbonato di sodio al 50-75 %m/V).

Costruzione della retta di taratura

La retta di taratura si costruisce misurando l’assorbanza di soluzioni a concentrazione esattamente nota di acido gallico nell’intervallo di concentrazione tra 4-140 mg/L preparate per diluizione da una soluzione madre a concentrazione 500 mg/L.

Preparazione della soluzione madre di acido gallico

Preparare una soluzione standard di acido gallico a concentrazione 500 mg/L pesando esattamente circa 50 mg di solido su una bilancia analitica. Trasferire quantitativamente il solido in un matraccio da 100 mL e portare a volume con acqua deionizzata (è possibile utilizzare un bagno ad ultrasuoni per favorire la dissoluzione). Nota: per ridurre l'errore sulla pesata è possibile pesare 500 mg in 1 litro ma in questo caso il consumo del reattivo (abbastanza costoso) aumenta notevolmente.

Preparazione degli standard

Prelevare volumi esattamente noti di soluzione standard di acido gallico compresi tra 1 e 7 mL ed introdurli in matracci tarati da 25 mL. Portare a volume con acqua deionizzata. Suggeriamo lo schema analitico riportato in Tabella 2 per la preparazione degli standard.

A queste concentrazioni il colore che si sviluppa trattando con il reattivo di Folin-Ciocalteu è troppo intenso. Per effettuare misure che rientrano in un intervallo di assorbanza compreso tra 0,2 e 0,8 unità, è necessario operare su campioni più diluiti. Per questo motivo, dopo aver preparato le soluzioni standard di acido gallico si procede come illustrato di seguito:

1. Prelevare 2,5 mL di soluzione standard di acido gallico in un matraccio da 25 mL.

2. Aggiungere 10 mL di reattivo di Folin-Ciocalteu diluito.

3. Agitare la soluzione per 5 minuti.

4. Portare a volume con carbonato di sodio al 7,5%.

5. Agitare vigorosamente e lasciare riposare al buio per due ore.

6. Prelevare con una pipetta Pasteur la soluzione di colore bluastro.

7. Se la soluzione non è limpida filtrare su filtro di Teflon da 0.45 mm (non utilizzare filtro di carta!).

8. Leggere l’assorbanza allo spettrofotometro alla lunghezza d’onda di 765 nm. Se si utilizza uno spettrofotometro a doppio raggio, misurare l'assorbanza del campione contro un cella di riferimento contenente solo acqua deionizzata.

Nota: dal momento che per l’analisi del campione si utilizza la stessa procedura (stesso volume prelevato e stessa diluizione), nella costruzione della retta di taratura si possono indicare direttamente le concentrazioni degli standard di acido gallico di partenza!

Preparazione del bianco reagenti

Preparare un bianco di riferimento sostituendo i 2,5 ml di standard con lo stesso volume di acqua deionizzata. Se si vuol determinare il limite di rivelabilità del metodo, preparare almeno 5 o 6 bianchi reagenti, determinare l’assorbanza media e la deviazione standard e calcolare LOD e LOQ come di consueto.

Analisi del campione di olio

I polifenoli hanno un carattere idrofilico, pertanto possono essere separati dal resto della matrice organica mediante estrazione liquido-liquido utilizzando un solvente a medio-alta polarità. Un buon solvente per l’estrazione è una miscela idroalcolica metanolo/acqua 70:30 in volume.

Estrazione dei polifenoli con solvente idroalcolico [3]

1. Pesare accuratamente circa 1 g di olio di oliva in una provetta da centrifuga.

2. Aggiungere 1 mL di n-esano e 5 mL della miscela idroalcolica e agitare per 10'.*

3. Trasferire in una provetta da centrifuga e centrifugare per 10’.*

4. Pipettare la fase idroalcolica (fase inferiore) in una seconda provetta da centrifuga pulita e asciutta e centrifugare ancora per altri 5’.*

5. Filtrare su filtri di Teflon da 0.45 mm (non utilizzare filtro di carta!).

* L'estrazione migliora se queste fasi vengono condotte a bassa temperatura (intorno a 4°C).

Analisi dell’estratto

Prelevare 2,5 ml di estratto e seguire la stessa procedura utilizzata per la costruzione della retta di taratura. Così facendo il risultato che si ottiene è direttamente espresso in mg/mL equivalenti in acido gallico.

Per l'elaborazione dei dati è stato predisposto un foglio elettronico con il quale è possibile costruire sia la retta di taratura che analizzare campioni incogniti. Nel foglio elettronico è presente anche una sezione dedicata alla determinazione dei limiti di rilevabilità e di quantificazione del metodo. Se si desidera fare queste valutazioni analitiche è necessario preparare almeno 4-6 diversi bianchi reagenti come indicato nella procedura.

Riportiamo di seguito i risultati ottenuti su alcuni campioni di olio di vario tipo analizzati in laboratorio (analisi effettuate nel mese di novembre 2020 con la classe 5AC, I.T. "Cattaneo" di San Miniato).

Riferimenti bibliografici