堂上奉祀的是藥王大帝,但這位主祀神明究竟何方神聖?還存有兩派爭議。
廟方認為是神農氏,但依據《臺南市市區史蹟調查報告書》則認為是古代名醫「扁鵲」。
與一般寺廟的坐北朝南方位相比,藥王廟是少見的坐西朝東。這主要是因為該廟主祀之藥王大帝即神農氏,也是司掌稼禾之神,面向東方有迎向生命之意。
藥王廟是府城七寺八廟之一,七寺:開元寺、法華寺、竹溪寺、彌陀寺、龍山寺、重慶寺、黃蘗寺。八廟:府城隍廟、武廟、大天后宮、水仙宮、藥王廟、東嶽廟、風神廟、龍王廟。 藥王廟主祀藥王大帝,更是當時藥材商人的信仰中心。
藥王廟上整齊地排列了八十一個門釘。「門釘」亦是門神的一種,多出現在供奉帝后等級的神明廟宇上。廟宇以九為倍數,以九乘九等於八十一個極限,表示不敢逾越皇宮門扉的一0八個門釘。
相傳神農大帝,又稱『五谷王』、『粟母王』、『五谷先帝』,一作『五谷仙帝』、『先帝爺』或『神農仙帝』,或稱『開天炎帝』,又因他遍嘗百草,故又稱之『藥王大帝』,傳統典籍稱之為「炎帝」。神農大帝,即炎帝神農氏,是神話中的一個帝王。神農氏發明農業,相傳他親嘗百草,作為醫藥,他又定每日中午成立交換貨物的市,于是人類生活,才得更進一步,走向光明,因此,尊奉他為先農,也有稱他為藥王。
神農的性情好生惡殺,由于人民當時還不知道吃穀類,都以動物為食,神農便立志教人開闢土地,種植五穀,讓人民以穀類為主食,於是為感念他之恩澤,便尊稱他為『神農』,即『神明于農業』之意。