John Marston est envoyé par les autorités fédérales et arrive dans la région du New Austin. On lui promet la liberté de sa famille s'il accepte de traquer ses anciens partenaires dont Bill Williamson. Dès son arrivée, il se confronte à lui mais est blessé. Il est secouru par Bonnie MacFarlane, une ranchera forte et indépendante qui dirige une ferme avec son père. Elle le soigne, lui apprend à survivre dans la région et lui fait découvrir le ranch. En retour, John aide Bonnie et sa famille. Malheureusement, la situation devient de plus en plus instable et les gangs de Bill gagnent de l'influence, poussant John à participer à diverses missions auprès des sherifs et marshalls de la région. Plus tard, les bandits capturent Bonnie pour forcer un échange de prisonniers. John accompagne alors le Marshall Leigh Johnson pour organiser la transaction qui tourne mal. Le prisonnier est tué, mais heureusement Bonnie est sauvée après avoir été suspendue à une corde, sur le point d'être exécutée. 

John se rend au Fort Mercer avec le Marshall Leigh Johnson afin de trouver Bill Williamson. Malheureusement, celui-ci a fui au Mexique pour rejoindre Javier Escuella. John traverse alors la frontière avec l'Irlandais. A leur arrivée, cela tourne mal puisqu'ils sont attaqués par des bandits. Après avoir survécu à l'embuscade, John fait la rencontre de Landon Ricketts, une ancienne légende de l'Ouest. Ensemble, ils viennent en aide aux habitants de Chuparosa et sauvent Luisa Fortuna, une révolutionnaire mexicaine. Luisa informe John que Javier Escuella et Bill Williamson sont bien présents au Mexique et qu'ils entretiennent des liens avec le gouvernement du Colonel Allende. John se retrouve pris entre les forces gouvernementales et les révolutionnaires dirigés par Abraham Reyes. Dans l'espoir de retrouver ses anciens compagnons, il accepte de travailler pour les deux camps. Lors d'une partie de poker à Chuparosa, un Allemand nommé Müller accuse John de tricherie, ce qui débouche sur un duel. Plus tard, plusieurs habitants défient également John en duel après avoir entendu parler de sa réputation de tireur. John explique à Landon Ricketts que Bill Williamson et Javier Escuella faisaient autrefois partie du même gang que lui sous les ordres de Dutch van der Linde. Après la dissolution du gang, ses anciens compagnons ont choisi une voie criminelle. Contraint par les agents fédéraux, John traque désormais Bill et Javier afin d'obtenir sa liberté et celle de sa famille.

En cherchant des informations, John rencontre le Capitaine Vincente de Santa, bras droit du Colonel Allende. De Santa lui promet son aide pour retrouver ses anciens compagnons si John accepte de travailler pour l'armée mexicaine contre les rebelles. Méfiant mais n'ayant pas d'autre piste, John accomplit plusieurs missions pour le gouvernement tout en collaborant également avec les révolutionnaires de Abraham Reyes. Malgré ses promesses, De Santa manipule continuellement John et l'utilise pour servir les intérêts du régime. Finalement, il le trahit en lui tendant un piège à Chuparosa sous prétexte que Bill et Javier y seraient retenus prisonniers. John échappe de peu à l'exécution grâce à l'intervention de Reyes et des rebelles. 

John aide ensuite Luisa à détruire un convoi militaire afin de venger son père et à faire tomber le De Santa. Il finit par obtenir des informations concernant Javier Escuella. Selon De Santa, celui-ci serait caché à la Casa Madrugada. Malheureusement, cette information était fausse et John tombe dans un piège tendu par l'armée mexicaine. Reyes lui fournit finalement le véritable emplacement de Javier, qui aurait été localisé à El Presidio, une imposante forteresse militaire. John participe alors à l'assaut aux côtés des révolutionnaires. Au terme de l'attaque, il se retrouve face à son ancien compagnon de gang. Il parvient à l'abattre, avant de le remettre aux autorités fédérales. 

Peu après, alors qu'elle tente de porter secours à Reyes, Luisa Fortuna est abattue par des soldats mexicains qui étaient en train de le maltraiter. Bouleversé par sa mort, John poursuit sa mission et participe à l'assaut final contre le régime. Après l'assaut, Bill et Allende tentent de s'enfuir ensemble. Ils sont capturés par les révolutionnaires. Reyes remet un fusil à John pour qu'il les exécute. 

John retourne à Blackwater afin de retrouver l'agent Ross. Alors qu'il espérait enfin revoir sa famille, Ross lui annonce que sa mission n'est pas terminée : il doit encore retrouver Dutch van der Linde. Les autorités ont reçu des informations indiquant que Dutch se cacherait à Serendipity. Accompagné de Ross et de ses hommes, John se rend sur place. Cependant, il s'agit d'un piège. Au lieu de trouver Dutch, ils découvrent Nastas, leur informateur, ligoté sur une chaise. Une embuscade éclate alors et les hommes de Dutch ouvrent le feu. Malgré la violence de l'attaque, John, Ross et les survivants parviennent à s'échapper de justesse. Déterminé à mettre fin à cette traque, John poursuit ses recherches dans la région de West Elizabeth. Avec l'aide de Nastas, il remonte progressivement la piste de Dutch, qui multiplie les attaques contre le gouvernement et les colons. Lors d'une rencontre avec les indigènes, Nastas est tué d'une balle en pleine tête. Cette chasse à l'homme conduit finalement John à affronter une dernière fois son ancien mentor, dont les idéaux ont laissé place à une lutte désespérée contre la civilisation qui gagne peu à peu l'Ouest américain.

Après la mort de Dutch, John Marston retourne à son ranch et retrouve sa famille. Pendant quelque temps, il mène une vie paisible avec sa femme, Abigail Marston, et son fils, Jack Marston. Cette période sert d'épilogue et montre John essayant de vivre comme un simple fermier. Mais les promesses des autorités ne sont pas tenues. L'agent Edgar Ross revient avec des soldats pour éliminer John et effacer définitivement les traces de son passé. Comprenant qu'il ne pourra pas s'en sortir, John aide sa famille à fuir puis affronte seul les assaillants. Il est finalement abattu après avoir ouvert la porte de sa grange et fait face à une importante force armée.

L'histoire avance ensuite de plusieurs années. Jack est devenu adulte. Après la mort de sa mère trois ans après celle de son père, il décide de retrouver Edgar Ross pour se venger. Jack finit par localiser Ross et le provoque en duel. Il le tue, accomplissant sa vengeance, mais laissant entendre qu'il risque à son tour de suivre le même chemin de violence que celui dont son père avait tenté de s'échapper...