Στην άσκηση αυτή θα ασχοληθούμε με κάποιες απλές αρχές της μοριακής εξέλιξης. Θα μελετήσουμε το βαθμό ομοιότητας αλληλουχιών μέσω πολλαπλών στοιχίσεων και θα δημιουργήσουμε φυλογενετικά δέντρα των εξελικτικών σχέσεων.
Για τους σκοπούς της σημερινής άσκησης θα χρησιμοποιήσουμε
α) Πρωτεϊνικές αλληλουχίες από διάφορους ευκαρυωτικούς
β)Ένα πρόγραμμα πολλαπλής στοίχισης (Τ-Coffee)
γ) Ένα πρόγραμμα δημιουργίας φυλογενετικών δέντρων (Clustal-W)
Αποκομιδή Αλληλουχιών
Αρχικά θα αναλύσουμε το γονίδιο μιας πολύ σημαντικής πρωτεϊνης, της ιστόνης Η4. Από τη σελίδα Shared Files (δείτε menu στα αριστερά), κατεβάστε το αρχείο με τίτλο histone4.txt που θα βρείτε στο τέλος της σελίδας. To αρχείο αυτό είναι ένα multifasta δηλαδή περιέχει πολλαπλές αλληλουχίες σε fasta format. Oι αλληλουχίες αυτές είναι οι πρωτεϊνικές αλληλουχίες της πρωτεϊνης Η4α για διάφορους ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Παρατηρήστε λίγο το αρχείο για να δείτε ποιοι είναι αυτοί οι οργανισμοί.
Πολλαπλή Στοίχιση
Για να εξάγουμε τις φυλογενετικές σχέσεις θα πρέπει πρώτα να κάνουμε μια πολλαπλή στοίχιση. Αυτή θα γίνει με τη βοήθεια του T-coffee ενός προγράμματος πολλαπλής στοίχισης που βασίζεται στην αρχή της μέγιστης σταθερότητας (consistency). Για να τρέξετε το T-coffee αρκεί να πλοηγηθείτε στην ιστοσελίδα του στο site του ΕΒΙ : http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/tcoffee/ . Στη σελίδα αυτή θα επικολλήσετε το αρχείο που κατεβάσατε προηγουμένως. Χωρίς να αλλάξετε τις ρυθμίσεις επιλέξτε SUBMIT. Το αποτέλεσμα εμφανίζεται στην οθόνη μετά από μερικά δευτερόλεπτα. Για να αξιολογήσετε καλύτερα την πολλαπλή στοίχιση επιλέξτε Show Colors για να δείτε τα αποτελέσματα χρωματισμένα με βάση το βαθμό συντήρησης.
Δημιουργία Φυλογενετικού Δέντρου
Θα δημιουργήσουμε στη συνέχεια ένα φυλογενετικό δέντρο με μια απλή αποστολή των αποτελεσμάτων της πολλαπλής στοίχισης στο Clustal W, ένα πρόγραμμα που κάνει φυλογενετική ανάλυση με βάση πολλαπλές στοιχίσεις. Επιλέξτε Send to ClustalW2_Phylogeny. Από τις επιλογές αλλάξτε μόνο το tree format από default σε clustal. Σε ό,τι αφορά την μέθοδο Clustering Method επιλέξτε Neighbour-joining. Στη συνέχεια επιλέξτε SUBMIT. Το αποτέλεσμα θα προβληθεί στην οθόνη σε δύο μορφές, μια μη-γραφική με παρενθέσεις και αγκύλες που ονομάζεται newick format και μια γραφική που είναι το δέντρο που ζητούμε. Τι παρατηρείτε; Ποια είδη βρίσκονται κοντά σε ποια άλλα; Είναι τα αποτελέσματα αναμενόμενα; Επιστρέψτε πίσω στο Clustal W και επαναλάβετε με την μέθοδο Clustering Method: UPGMA. Αλλάζει κάτι στο δέντρο; και τι;
Να επαναλάβετε όλη τη διαδικασία για μια άλλη πρωτεϊνη της οικογένειας των ιστονών, την Η1 (histone1.txt). Τι συμπεράσματα βγάζετε συγκρίνοντας το δέντρο της Η4 και της Η1;
1. Ποια πρωτεΐνη είναι πιο συντηρημένη από τις δύο;
2. Το εξελικτικό δέντρο ποιας πρωτεΐνης αντανακλά με τον καλύτερο τρόπο τις εξελικτικές σχέσεις που περιμένουμε να παρατηρήσουμε μεταξύ των συγκρινόμενων ειδών;
3. Μεταξύ των μεθόδων UPGMA και NJ ποια αποδίδει το καλύτερο δέντρο με βάση το παραπάνω κριτήριο;
4. Δοκιμάστε να δημιουργήσετε από ένα δέντρο με τις στοιχίσεις που προκύπτουν από τη χρήση των PAM/BLOSUM πινάκων στο T-Coffee. Σε ποιο βαθμό διαφέρουν τα συναγόμενα δέντρα από το αρχικό;